Сельскохозяйственная биология, 2010, № 3, с. 118-124.

УДК 581.8:57.086.8:57.088.53

ПРИМЕНЕНИЕ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ МИКРОТОМОГРАФИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРЕННЕГО СТРОЕНИЯ РАСТЕНИЙ

И.С. ВИНОГРАДОВА¹, О.В. ФАЛАЛЕЕВ²

Методом магнитно-резонансной микротомографии на ядрах протонов проводили исследования состояния и распределения подвижных молекул воды в растениях фасоли и тыквы разных сортов. Получены двумерные изображения — томограммы семян с неодинаковым содержанием воды, на семенах фасоли сорта Лима изучена динамика набухания и состояние воды при температурах от комнатной до -30 °С. Показаны возможности томографических исследований корневой системы растений без извлечения их из почвы, а также про-водящей системы стеблей.

Ключевые слова: метод магнитно-резонансной томографии (МРТ), набухание семян, распределение воды в поровом пространстве семян, действие низких температур на семена, томография корней и стеблей растений, фасоль сорта Лима, растение тыквы.

Большинство современных методов исследования внутренней структуры растений инвазивны, поскольку связаны с разрушением тканей изучаемых объектов. В первую очередь это стандартные способы получения светооптических изображений с помощью микроскопов. В последнее время разрабатываются подходы, позволяющие получить биообразы тканей растений, не прибегая к деструкции. К их числу относятся томографические методики.

Появление метода магнитно-резонансной микротомографии, или ЯМР-томографии, относят к середине 1980-х годов (1). Прием основан на импульсном методе ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). Он сначала получил практическое применение в медицине и в настоящее время широко используется для диагностики костной патологии, обнаружения опухолей, для оперативного контроля при лечении заболеваний, а также при изучении функциональной активности головного мозга. Современные методики позволяют получать изображения внутренней структуры исследуемых образцов и изучать протекающие в них процессы с разрешением до 100 мкм. Главное преимущество метода ЯМР в том, что в нем не используется ионизирующее излучение, что делает установки ЯМР-томографии безвредными для объектов. Среди ядер, на которых проводятся исследования методом ЯМР, наибольший интерес представляют ядра водорода — протоны, поскольку в виде молекул воды и других содержащих протоны групп они наиболее распространены в различных объектах. Кроме того, чувствительность метода ЯМР на этих ядрах по сравнению с другими относительно высока. Поэтому подавляющая часть исследований с использованием ЯМР-томографии выполнена на ядрах протонов.

 Особенно перспективно использовать ЯМР при исследованиях пористых, содержащих жидкости материалов (2), какими являются ткани растений (3). Метод позволяет изучать распределение жидкости в поровом пространстве. Амплитуда сигнала ЯМР для элемента изображения пропорциональна количеству жидкости в пределах соответствующего элемента образца. Как известно, вода составляет до 95 % биомассы растений и участвует во всех физиологических процессах, в связи с чем применение ЯМР-томографии как метода неразрушающего контроля за водным режимом растения в течение жизненного цикла представляет большой интерес.

В настоящей работе мы получали МРТ-изображения (магнитно-ре-зонансные микротомографические изображения) семян с разным содержанием  воды, в процессе набухания, при температурах до -30 °С, а также стеблей и корневой системы.

Методика. Исследования проводились на семенах и растениях фасоли (сорта Лима, Сакса) и тыквы (сорта Волжская серая, Стофунтовая) в Красноярском региональном центре коллективного пользования Сибирского отделения РАН на микротомографе фирмы «Bruker» (Германия) со следующими параметрами: сверхпроводящий магнит с индукцией магнитного поля 4,7 Тл, вертикальным отверстием диаметром 89 мм и набором радиочастотных катушек с максимальным диаметром 37 мм.

В работе применялась методика спинового эха, при которой на образец подается периодически повторяющаяся последовательность радиочастотных импульсов (90 и 180°). На полученных изображениях (томограммах) выделяются светлые и темные участки; более светлые соответствуют большему локальному содержанию подвижных молекул воды. Измерения выполнялись в нескольких проекциях с толщиной среза 1,0 мм. При томографии семена можно располагать в радиочастотном контуре спектрометра так, что их наибольшая ось будет параллельна либо перпендикулярна внешнему магнитному полю (соответственно вертикальное либо горизонтальное расположение), а томографические срезы производить в трех взаимно перпендикулярных плоскостях (мы использовали поперечные и продольные срезы, соответственно перпендикулярные и параллельные зародышевой оси).

У фасоли сорта Лима анализировали воздушно-сухие семена, а также динамику поступления и распределения в них воды при набухании. Для этого в радиочастотный контур спектрометра NMR 300 MHz («Bruker», Германия) внутри стеклянной ампулы помещались по 2-3 образца воздушно-сухих семян, которые заливались дистиллированной водой. Через определенные промежутки времени записывались томограммы для продольных и поперечных срезов (большая часть измерений выполнялась на поперечных срезах, оказавшихся в наших исследованиях наиболее информативными). Для иллюстрации возможностей получения томографических изображений при разных температурах исследовали процессы замораживания воды в набухших семенах фасоли этого сорта, анализируя поперечные срезы образца, помещенного в радиочастотный контур наибольшим размером вертикально, при охлаждении парами азота (25, 0, -15 и -30 °С,  температуру контролировали термопарой). Кроме того, для фасоли сорта Лима оценили возможность томографического исследования корневой системы без извлечения растения из почвы. Для этого предварительно замоченные и проклюнувшиеся семена высаживались в пробирку диаметром 30 мм, заполненную обычным коммерческим грунтом. Примерно через 1 нед появлялись всходы, которые доращивали до появления первых листьев. Пробирку размещали в радиочастотном контуре спектрометра. Для фасоли этого сорта характерно гипогейное прорастание семян, то есть семядоли остаются в почве. В наших опытах они занимали большую часть полезного объема, мешая корневой системе нормально развиваться. Поэтому мы дополнительно записали томограммы корневой системы того же растения, вынутого из почвы.

У фасоли сорта Сакса изучали семена, прошедшие стадию набухания до состояния проклевывания корешка.

У тыквы сорта Волжская серая анализировали семена, извлеченные из плода непосредственно перед экспериментом.

У растений тыквы сорта Стофунтовая получали микротомограммы поперечных срезов стеблей, сравнивая результаты с данными световой микроскопии, выполненной стандартными методами (4) на тонких (10-15 мкм) срезах с окрашиванием сафранином или другим красителем.

Результаты. В отличие от обычного импульсного ЯМР в томографии используется градиентное внешнее поле (в этом случае резонансная частота будет изменяться пропорционально координате в выбранном направлении). Для исследования объемных тел градиентное поле создается в трех взаимно перпендикулярных направлениях, что позволяет производить анатомические срезы трехмерного тела. Для этого на время возбуждения образца формируется градиент внешнего поля в направлении, перпендикулярном плоскости нужного среза. В результате при заданной частоте возбуждения атомных ядер в возбужденное состояние перейдут только те ядра, для которых эта частота является резонансной, то есть те, которые лежат в выбранном плоском сечении тела. Метод позволяет получать изображения отдельных срезов, глубина и ориентация которых задаются оператором. Пространственное разрешение метода 0,5 мм. Для повышения интенсивности сигналов используется их накопление. Изображение объекта создается с помощью компьютера, который выполняет двумерное преобразование Фурье. Обычно можно одновременно регистрировать до 30 срезов и более. С нашей точки зрения, исследования МРТ-изображений корневой системы растения в почве, наблюдение за динамикой ее развития, эффектом высоких и низких температур, тяжелых металлов, а также других важных для теории и практики семеноведения и растениеводства факторов очень перспективны, поскольку другими методами осуществить их невозможно.

Т о м о г р а ф и ч е с к и е  и с с л е д о в а н и я  с е м я н  р а с т е н и й  с  р а з л и ч н ы м  с о д е р ж а н и е м  в о д ы. Хотя вода в жизни семян играет особую роль и определяет их состояние на всех этапах от созревания до прорастания, вопросы водного режима семян наименее изучены. Достоверно установлено, что в состоянии молочной спелости влажность семян равняется 65-70 %, к моменту достижения фазы полной спелости — снижается до 30-40 %, наконец, на третьем этапе цикла, когда семена быстро обезвоживаются и переходят в воздушно-сухое состояние, — составляет от 3-5 до 15-18 % у разных типов семян (5). Как известно, семена могут длительное время существовать как самостоятельный организм, пока новый контакт с водой не переведет их в стадию набухания с последующим прорастанием.

Разные этапы взаимодействия семян с водой хорошо воспроизводятся на полученных нами томографических снимках. На томограмме воздушно-сухих семян фасоли сорта Лима (рис. 1, а) три образца помещены вертикально в радиочастотный контур с залитой в него дистиллированной  водой, которая создает на изображении белый фон, контрастирующий с семенами. Приведен поперечный срез примерно в средней части семян, на котором видны две семядоли и воздушная прослойка между ними (она выглядит более темной). При набухании семян вода поступает внутрь, постепенно осветляя участки, в которые попадает.

На поперечных срезах у одного из предварительно набухавших в воде до состояния проклевывания семян (фасоль сорта Сакса, см. рис. 1, б) виден выступающий корешок. Образцы полностью оводнены, на верхнем осталась щель между семядолями, заполненная воздухом. Семена этого сорта характеризуются довольно равномерным набуханием.

Исследованные продольные срезы также оказались весьма информативными. Так, на микротомограмме  среза двух семян фасоли сорта Лима у одного из набухающих семян (см. рис. 1, в), в центральной части видны содержащая воздух щель (темная область) и заполняющиеся водой семядоли (особенно интенсивно — в нижней части).

В верхней части хорошо выделяется зародышевая ось с семяпочкой и корешком. Семенам этого сорта свойственно неоднородное оводнение: даже в полностью набухших образцах имеются затемненные участки. Наибольшее количество воды сконцентрировано в области корня, что соответствует результатам, полученным ранее другими методами (5). Томограмма семени справа соответствует начальной стадии набухания, вода начинает поступать в участки, расположенные под кожурой; в нижней левой части семени также видна семяпочка. Особенность семян у фасоли сорта Лима— сравнительно большие размеры и масса, которая может превышать 2 г.

На томограммах семян тыквы сорта Волжская серая, которые перед экспериментом извлекли из плода (см. рис. 1, г), видно, что они содержат достаточно большое количество воды, так как еще не перешли в воздушно-сухое состояние. Свежеизвлеченные семена максимально и равномерно оводнены. На снимке представлены поперечные срезы семян, положенных в контуре горизонтально (воздух между ними создает темный фон).

Таким образом, томографический эксперимент позволяет оценивать степень оводненности семян и может использоваться в агрономической практике для решения задач сохранности зерна.

И с с л е д о в а н и я  с е м я н  п р и  н и з к и х  т е м п е р а т у р а х. Гибель растений от понижения температуры вызвана образованием кристаллов льда, в связи с чем необходимо изучать условия, локализацию и механизм их формирования. Использование метода МРТ для решения этих задач может оказаться перспективным и информативным.

Результаты эксперимента с семенами фасоли сорта Лима приведены в нижнем ряду рисунка 1. У набухшего семени при комнатной температуре (25 °С) в воздушной среде, создающей темный фон, видны две полностью оводненные семядоли, разделенные воздушной щелью, которая сохранилась в правой части семени. При понижении температуры до 0 °С изображение почти не изменяется, затем (-15 °С) начинается кристаллизация воды, характеризующаяся появлением темных пятен внутри семени. При -30 °С изображение семени полностью исчезает, что соответствует полному замерзанию. При размораживании наблюдается температурный гистерезис, и при 0 °С еще не вся вода переходит в жидкое состояние.

Д и н а м и к а  н а б у х а н и я  с е м я н. Наибольший интерес представляет изучение динамики и способа поступления воды в семена в процессе набухания. Большинство исследователей считают, что вода проникает через определенные участки поверхности, у семян фасоли — возможно, через ткань рубчика (6) или микропиле (7). Однако этот вопрос оказался наиболее дискуссионным, поскольку прямые «неинвазивные» наблюдения были невозможны. Использование ЯМР-томографии позволяет вести такие наблюдения и анализировать последовательность процесса поступления воды, степень оводненности различных частей се-мени, скорость поступления воды в отдельные участки и другие особенности процесса набухания.

Рис. 2. Двумерные МРТ-изображения (МРТ — магнитно-резо-нансная томография) поперечных срезов двух семян фасоли сорта Лима, отражающие динамику процесса набухания, начиная с воздушно-сухого состояния (0 ч). Верхний и нижний ряд различаются высотой, на которой проводились срезы (в нижнем — сканы срезов, проходящие через зародышевую ось и содержащие поперечный срез корешка).

Эти эксперименты мы проводили в нескольких повторах с разными об-разцами семян фа-соли сорта Лима. Полезный объем ра-диочастотного контура позволяет разме-щать в нем несколько образцов. Мы использовали, как правило, два либо три образца, которые располагали вертикально в контуре и заливали дистиллированной водой, ее количество определяли предварительно, для чего в нескольких повторах измеряли массу набухающих семян в зависимости от времени контакта с водой. Было установлено, что у большинства семян первая фаза заканчивается в течение 12-15 ч, но вследствие разнокачественности у некоторых образцов процесс был значительно более длительным. При набухании масса семян возрастала в среднем на 100 % от исходной воздушно-сухой.

На рисунке 2 представлены томограммы для двух семян фасоли, помещенных вертикально в контуре и залитых дистиллированной водой (всего выполнили по 25 срезов через 1 мм в динамике поступления воды; на рисунке приведена часть полученных изображений). В исходном воздушно-сухом состоянии (0 ч) семена выглядят темными на белом фоне, создаваемом залитой в контур дистиллированной водой. Поступление воды в семена фиксировали по появлению белых участков на изображении. Наблюдения позволили заключить, что вода действительно поступает в семена через определенные участки поверхности (микропиле, ткань рубчика и строфиолярную щель). Проходя под кожуру, вода вызывает появление на ней складок, которые можно наблюдать как визуально, так и на томограммах (особенно в нижнем ряду). Внутри семени вода проникает сначала к зародышевой оси — к основанию корешка, который находится в непосредственной близости от микропиле (он начинает светиться первым и остается наиболее яркой точкой, что свидетельствует о высоком содержании воды в этой области). На снимках в нижнем ряду (см. рис. 2) это яркий светящийся круг на образце справа. Наши данные хорошо согласуются с опубликованными: сообщалось, например, что у семян кукурузы содержание воды за период контакта с водой в зародыше увеличивается в 800, а в семядолях — всего в 5-50 раз (5). Далее оводняется тонкий слой семядолей по их периметру и заполняется водой воздушная щель между семядолями. Только после этого вода начинает поступать в семядоли, но продвигается она не сплошным фронтом, как это предполагалось ранее (7). Внутри семя неоднородно, поэтому не выполняются положения, выдвинутые в обзоре J.D. Bewley и V. Black, о равномерном продвижении воды. Наиболее заметны такие неоднородности на последнем снимке из верхнего ряда на правом образце (см. рис. 2).

Учитывая разнокачественность семян, наличие внутри микро- и макродефектов, строение и свойства оболочки, полученную в наших экспериментах модель мы рассматриваем как одну из возможных. В частности, у различных групп семян ее детали могут не совпадать.

Рис. 3. Двумерные МРТ-изображения (МРТ — магнитно-резонансная томография) корневой системы фасоли сорта Лима  (а — в почве, б — после извлечения из почвы; 1 и 2 — соответственно семядоли и главный корень) (верхний ряд), а также схематическое строение стебля тыквы сорта Стофунтовая по данным микроскопических (в) и томографических (г) исследований (нижний ряд). В правой части изображений (сканов) приведен масштаб (мм).

По мере того, как вода поступала внутрь семян, ее количество в пространстве между ними уменьшалось, и на томограммах появились темные области, заполненные воздухом (через 8 ч воду в контур доливали).

И с с л е д о в а н и е  к о р н е в о й  с и с т е м ы  и  с т е б л е й.Если на семенах фасоли Лима, как оказалось, очень удобно изучать процессы набухания, то наблюдения за корневой системой, наоборот, были затруднены, поскольку у указанного сорта семядоли остаются в почве и занимают большую часть объема пробирки. Из-за этого основной корень загибается вверх, а из семядолей вырастают боковые корни и несколько побегов. Большую часть микротомограммы занимали разбухшие семядоли;  главный корень проходил под семядолями и изгибался вверх (рис. 3). На выбранном срезе образца, вынутого из земли, основную часть занимают семядоли, на которых видны неоднородности, обусловленные изменениями в процессе роста. Между семядолями располагался поперечный срез гипокотиля — переходной области между корнем и стеблем. Хорошо видна его структура и различная степень оводненности отдельных частей.

Согласно данным световой микроскопии, стебель у растений изученного сорта тыквы Стофунтовая округлый или округло-пятиугольный с пятилучевой воздушной полостью. Между лучами полости расположены пять крупных проводящих пучков. Против лучей полости ближе к краю стебля находится второе кольцо из пяти таких же более мелких пучков. Томограмма стебля хорошо воспроизводила детали этой структуры — на снимке (см. рис. 3) участки, заполненные водой, выглядят более темными. В центре томограммы наблюдали белую пятилучевую воздушную полость и черные проводящие пучки (содержание жидкой воды в них значительно больше, чем в остальных тканях стебля). 

Итак, магнитно-резонансная микротомография (МРТ) может успешно использоваться при исследовании онтогенеза растений и решении многих вопросов, связанных с контролем водного режима. Особенно перспективно использовать метод при исследовании семян растений, поскольку их водный статус в период набухания и прорастания может влиять на последующее развитие и рост растения. Хотя данные о поглощении воды семенами достаточно многочисленны, о ее пространственном и временном распределении известно немногое. Знание структурных изменений, вызванных поступлением воды в сухие семена, важно для понимания процессов активации жизнедеятельности растения. Обнаруженная нами пространственная неоднородность распределения воды в семядолях может коррелировать с градиентами накопления запасенных веществ. Наши результаты показали, что активация микропиле и ткани рубчика в качестве каналов для поступления воды, поставка воды к корешку зародыша в пределах семенной кожуры, набухание семядолей и дальнейшее увеличение содержания воды — физиологически различные процессы, которые можно дифференцировать с помощью локализации воды методом МРТ в разных тканях семени. Биологическая роль распределения воды может оказаться важной не только для процессов прорастания, но и для оценки качества семян.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. C a l l a g h a n  P.T. Principles of nuclear magnetic resonance microscopy. N.Y., 1991.
2. К о п т ю г  И.В.,  С а г д е е в  Р.З.Современные физико-химические приложения ЯМР-томографии. Специфика метода и его применение для исследования объектов, содержащих жидкости. Успехи химии, 2002, 71(7): 672-699.
3. П о п ц о в  А.В.,  Н е к р а с о в  В.И.,  И в а н о в а  И.А. Очерки по семеноведению. М., 1981.
4. Б а р ы к и н а  Р.П.,  К о с т р и к о в а  Л.Н.,  К о ч е м а р о в а  И.П. и др. Практикум по анатомии растений: Уч. пос. для студентов биол. спец. вузов /Под ред. М. Транковского. М., 1979.
5. А с к о ч е н с к а я  Н.А. Водный режим семян. В сб.: Физиология семян /Под ред. А.А. Прокофьева. М., 1982: 184-222.
6. Э с а у  К. Анатомия растений. М., 1969.
7. B e w l e y  J.D.,  B l a c k  V. Physiology and biochemistry of seeds in relation to germination.  Vol. 1. Berlin, Springer-Verlag, 1978.

APPLICATION OF NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE IMAGING METHOD FOR RESEARCH OF AN INTERNAL STRUCTURE OF PLANTS

I.S. Vinogradova¹, O.V. Falaleev²

Proton nuclear magnetic resonance imaging study of water distribution in plants of haricot and cucurbit was carried out using a Bruker 300 MHz NMR spectrometer. Two-dimensional NMR-images were obtained in seeds with the different contents of water; the germination and freezing phenomena were studied from room temperature to -30 ⁰C for Lima haricot. The applications magnetic resonance imaging were illustrated for study of the roots of haricot plants and conductive system of cucurbit caulis.

Key words: magnetic resonance imaging method (MRI), swelling of seeds, water distribution in pores of seeds, freezing of seeds, imaging of roots and caulis, Lima haricot, plants of cucurbit.

Оформление электронного оттиска