Сельскохозяйственная биология, 2010, № 3, с. 76-81.

УДК 633.11:632.4:632.938.1

НАЛИЧИЕ ДНК-МАРКЕРОВ КАК КРИТЕРИЙ ПОСТУЛЯЦИИ Lr -ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ Triticum aestivum L. К ЛИСТОВОЙ РЖАВЧИНЕ Puccinia triticina Erikss.: КРИТИЧЕСКИЙ ВЗГЛЯД

Л.Г. ТЫРЫШКИН

Используя фитопатологический тест, изучили наличие генов устойчивости к листовой ржавчине Lr1, Lr10, Lr20, Lr26 и Lr34 у 44 образцов мягкой пшеницы, для которых присутствие этих генов ранее постулировалось по результатам STS- или SSR-анализа. Доказано отсутствие перечисленных генов соответственно у 6, 18, 2, 2 и 3 сортов, что указывает на нетесное сцепление ДНК-маркеров и генов устойчивости к болезни. Анализ данных лите-ратуры показывает, что эффективные гены ювенильной устойчивости — Lr9, Lr19 и Lr24 также не всегда тесно сцеплены с разработанными для них STS маркерами.

Ключевые слова: пшеница, листовая ржавчина, гены устойчивости, ДНК-маркеры.

Бурая (или листовая) ржавчина, возбудителем которой является  Pucciniatriticina Erikss. [syn.: P. recondita Roberge: Desm. f. sp. tritici (Erikss.) C.O. Johnston], — одна из основных вредоносных болезней пшеницы (Triticumaestivum L.) в большинстве регионов возделывания. Наиболее экономически выгодным и экологически безопасным методом борьбы с заболеванием служит выращивание устойчивых сортов. Однако запас эффективных генов устойчивости к болезни крайне мал: все высокоустойчивые в ювенильной стадии роста образцы из Мировой коллекции Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР) защищены только генами Lr9, Lr19, Lr24 и Lr41 (1).

Один из способов продления «полезной жизни» гена устойчивости — «пирамидирование» генов, при котором в один генотип сорта передают несколько эффективных генов либо эффективный и несколько малоэффективных. В качестве мощного инструмента для селекции сортов пшеницы, содержащих несколько генов устойчивости к листовой ржавчине, рассматривается использование молекулярных ДНК-маркеров, поскольку только по фенотипу отличить линии, несущие один эффективный ген, от линий, имеющих более одного гена, невозможно.

В настоящее время ДНК-маркеры разработаны для 30 Lr-генов, но накоплены достаточно обширные сведения, что маркеры, первоначально описанные как строго специфичные для конкретного гена, не всегда тесно сцеплены с ним (2-5). Несмотря на этот факт, в отечественной научной литературе появляются публикации, в которых постуляция генов устойчивости к листовой ржавчине проводится только на основании наличия определенного ДНК-маркера (6-10). Очевидно, что при отсутствии тесного сцепления между маркером и геном резистентности подобный подход может приводить к ошибочной идентификации такого гена у изучаемого образца.

Цель настоящей работы — экспериментально верифицировать присутствие генов устойчивости Lr1, Lr10, Lr20, Lr26 и Lr34 у сортов пшеницы, для которых наличие указанных генов определено только на основании амплификации их молекулярных маркеров (5-10).

Методика. Монопустульные изоляты P. triticina выделяли из популяции патогена, собранной в Северо-Западном регионе России. Отрезки 1-х листьев длиной 0,8-1,0 см, взятых с растений пшеницы сорта Тэтчер  и его почти изогенных линий (ThLr) с генами устойчивости к листовой ржавчине Lr1, Lr20 и Lr26, раскладывали в кюветы на вату, смоченную водой, и заражали монопустульными изолятами гриба. Кюветы закрывали стеклом и на 12 ч помещали в темноту, а затем в светоустановку (21 °С,  постоянное освещение). Учет типа реакции на заражение проводили на 6-7-е сут после инокуляции по шкале Майнса-Джексона (11): 0 — отсутствие симптомов поражения, 0; — некрозы без пустул, 1 — очень мелкие пустулы, окруженные некрозом, 2 — пустулы среднего размера, окруженные некрозом или хлорозом, 3 — пустулы среднего и крупного размера без некроза. Для выделения изолятов патогена, тестирующих гены Lr10 и Lr34, отрезки 1-х листьев длиной 0,5 см того же сорта и его почти изогенных линий с этими генами устойчивости раскладывали в кюветы на вату, смоченную водным раствором бензимидазола (концентрация 100 мг/л) и заражали изолятами P. triticina; кюветы переносили в климатическую камеру (25 °С, постоянное освещение)(12). Типы реакции учитывали по вышеуказанной шкале на 7-8-е сут после инокуляции.

По пять отрезков листьев, взятых с растений образцов мягкой пшеницы из Мировой коллекции ВИР, для которых присутствие генов устойчивости Lr1, Lr10, Lr20, Lr26 и Lr34 определено только на основании наличия молекулярных маркеров, раскладывали в один ряд на вату, смоченную водой либо водным раствором бензимидазола, и заражали изолятами возбудителя ржавчины, авирулентными в отношении соответствующего гена устойчивости. Типы реакций сортов и линий учитывали на 6-8-е сут после инокуляции патогеном. Поскольку взаимодействие в системе пшеница—возбудитель листовой ржавчины подчиняется постулату H.H. Flor «ген-на-ген» (13), восприимчивость сорта к изоляту патогена, авирулентному для линии сорта Тэтчер с определенным геном устойчивости, доказывает отсутствие функционального аллеля этого гена у изучаемого образца. Для контроля заражения в конце каждого ряда помещали отрезки листьев растений сорта Тэтчер. Устойчивым контролем служили отрезки листьев образцов пшеницы, у которых перечисленные гены выявлены при гибридологическом анализе: ген Lr1 — Dirkwin, Lr10 — Mayo 52, Lr20 — Thew, Lr26 — Кавказ и Lr34 — Glenlea (14).

Результаты. Клоны возбудителя листовой ржавчины, авирулентные для линии ThLr1, были вирулентными в отношении шести из восьми изученных сортов пшеницы, у которых ранее обнаружен STS-маркер (sequence tagged site) гена Lr1 (6, 9), — Doublecrop, Хазарка, Omega, Hope, Прохоровка и Родина; следовательно, они не могут иметь этот ген устойчивости. У двух остальных сортов — Roblin и Pasqua наличие гена Lr1 исключить нельзя.

Из образцов, для которых показана амплификация STS-маркера гена устойчивости Lr20 (6), в коллекции ВИР имеются только три; два из них (Заря и Planet) оказались восприимчивыми к клонам P. triticina, авирулентным к этому гену, то есть ген резистентности Lr20 у них отсутствует. Отрезки листьев растений сорта Omega и линии ThL20 проявили идентичную реакцию на заражение клонами, поэтому, скорее всего, указанный сорт защищен геном Lr20.

По данным молекулярного анализа (5, 6), четыре изученных сорта имеют ген устойчивости к ржавчине Lr26, однако по результатам проведенного нами фитопатологического теста в генотипе сортов Prospect и Equinox он присутствовать не может (табл. 1).

Отрезки листьев растений 18 из 22 сортов, для которых была показана амплификация STS-маркера, сцепленного с геном устойчивости Lr10 (5, 6, 8-10), проявили восприимчивость по крайней мере к одному из четырех авирулентных к этому гену клонов возбудителя ржавчины, использованных для инокуляции (табл. 2).

Только для четырех образцов (Prospect, AC Domain, Прохоровка и Roblin) результаты фитопатологического теста не опровергали гипотезу о наличии у них гена устойчивости Lr10.

Тип реакции линии ThLr34 на заражение четырьмя клонами P. tri-ticina— 0;, то же наблюдали для четырех из семи сортов, которые описаны как носители гена устойчивости Lr34 на основании SSR-анализа (simple sequence repeat) (6) (табл. 3). Результаты заражения тест-клонами исключали возможность присутствия этого гена у сортов Lerma Rojo 64, Заря и Doublecrop.

Полученные данные указывают на высокую частоту ошибочной идентификации генов устойчивости пшеницы к листовой ржавчине Lr1, Lr10, Lr20, Lr26 и Lr34 по наличию ДНК-маркеров как единственному критерию постуляции.

Так, STS-маркер pTAG621 (15), по результатам многих исследований, сцеплен с геном Lr1 не тесно, однако амплификацию этого маркера рассматривают как единственное доказательство наличия указанного гена у сортов пшеницы современной селекции (6), а также у сорта Родина и многих его производных с чужеродным генетическим материалом (7, 9).  По нашим данным, полученным в фитопатологическом тесте, ген Lr1 отсутствует у шести из восьми изученных образцов. С использованием молекулярного маркера Lrk 10D (16) ген Lr10 постулирован у многих современных сортов пшеницы (5, 6, 8, 10). В то же время по результатам нашего фитопатологического тестирования у большинства из этих образцов он отсутствует: только у четырех форм из 22, для которых ранее показана амплификация Lrk 10D, этот ген может присутствовать (см. табл. 2). Для четырех сортов пшеницы сообщалось об амплификации фрагмента ДНК длиной 542 п.н. при использовании праймеров к маркеру STS638 (17), на основании чего сделан вывод о наличии у них гена Lr20 (6). Из этих образцов мы изучили три, причем два, как показал фитопатологический тест, не могут нести указанный ген. Амплификация молекулярного маркера IB-267, тесно сцепленного с геном Lr26 (18), рассматривается как доказательство его присутствия у 11 сортов пшеницы (6). В коллекции ВИР имеются только три из них, при этом у одного (сорт Prospect) наличие гена Lr26 опровергается результатами фитопатологического теста (см. табл. 1). У сорта Equinox названный ген постулирован на основании STS-анализа (5), однако в нашем тесте сорт поражается клонами, авирулентными к ThLr26 и, следовательно, не может иметь Lr26. Наконец, ген Lr34 постулирован у 18 сортов мягкой пшеницы на основании наличия амплификации SSR локуса Xgdwm295 (6). Из семи изученных нами сортов для трех доказано отсутствие гена Lr34 (см. табл. 3).

Анализ данных литературы показывает, что гены эффективной ювенильной устойчивости также не всегда тесно сцеплены с разработанными для них молекулярными маркерами. Например, маркер J 13 (19), по результатам многих исследований, тесно сцеплен с геном Lr9. В то же время амплификация этого маркера показана для четырех линий пшеницы с генетическим материалом от Aegilops speltoides и Triticum kiharae (7). В публикации сообщалось, что в работе не использовали патотипы возбудителя ржавчины, вирулентные к гену устойчивостиLr9, однако некоторыми клонами эти линии поражались, следовательно, они не могут нести функционально активный аллель указанного гена устойчивости. Таким образом,

Lr9 нельзя считаться тесно сцепленным с маркером J 13 (по крайней мере, у форм пшеницы, полученных в результате интрогрессивной гибридизации). STS-маркер Gb (20), как считается, тесно сцеплен с Lr19. Этому противоречит факт, что у одной из линий сорта Родина с генетическим материалом от Ae. triuncialis ген Lr19 постулирован по результатам STS-анализа с использованием праймеров к маркеру Gb (9), однако этот маркер не амплифицировался ни у материнской (сорт Родина), ни у отцовской (Ae. triuncialis) формы. Несмотря на сообщения о тесном сцеплении STS-маркера J 09 с Lr24 (21), по крайней мере два факта свидетельствуют, что эта сцепленность неполная. Во-первых, среди почти изогеннных линий серии Тэтчер указанный маркер амплифицируется как у линии с геном Lr24, так и у линии с геном Lr25 (22). Во-вторых, амплификацию наблюдали у двух линий сорта Родина с генетическим материалом от Ae. triuncialis и T. kiharae (9), однако функционально активный аллель гена Lr24 не может присутствовать у этих линий, поскольку в исследовании были выделены вирулентные для них клоны P. recondita, которые невирулентны к гену устойчивостиLr24.

Итак, полученные экспериментальные данные и анализ литературы доказывают, что разработанные ДНК-маркеры генов устойчивости пшеницы к листовой ржавчине Lr1, Lr9, Lr10, Lr19, Lr20, Lr24, Lr26 и Lr34 не всегда тесно сцеплены с этими генами. Очевидно, что до проведения отбора линий, имеющих несколько генов устойчивости, с помощью ДНК-маркеров (marker assisted selection) необходима проверка тесного сцепления маркера и гена резистентности у каждого донора.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Т ы р ы ш к и н  Л.Г. Генетический контроль эффективной ювенильной устойчивости коллекционных образцов пшеницы Triticumaestivum L. к бурой ржавчине. Генетика, 2006, 42(3): 377-384.
2. C h e l k o w s k i  J.,  G o l k a  L.,  S t e p i e n  L. Application of STS markers for leaf rust resistance genes in near-isogenic lines of spring wheat cv. Thatcher. J. Appl. Genet., 2003, 44: 323-338.
3. K h a n  R.R.,  B a r i a n a  H.S.,  D h o l a k i a  B.B.,  N a i k  S.V.,  L a g u  M.D.,  R a t-
j e n  A.J.,  B h a v a n i  S.,  G u p t a  V.S. Molecular mapping of stem and leaf rust resistance in wheat. Theor. Appl. Genet., 2005, 111: 846-850.
4. N o c e n t e  F.,  G a z z a  L.,  P a s q u i n i  M. Evaluation of leaf rust resistance genes Lr1, Lr9, Lr24, Lr47 and their introgression into common wheat cultivars by marker-assisted selection. Euphytica, 2007, 155: 329-336.
5. S t e p i e n  L.,  G o l k a  L.,  C h e l k o w s k i  J.Leaf rust resistance genes of wheat: identification in cultivars and resistance sources. J. Appl. Genet., 2003, 44: 139-149.
6. У р б а н о в и ч  О.Ю.,  М а л ы ш е в  С.В.,  Д о л м а т о в и ч  Т.В.,К а р т е л ь  Н.А.Определение генов устойчивости к бурой ржавчине в сортах пшеницы (Triticumaestivum L.) с использованием молекулярных маркеров. Генетика, 2006, 42(5): 675-683.
7. Г а й н у л л и н  Н.Р.,  Л а п о ч к и н а  И.Ф.,  Ж е м ч у ж и н а  А.И.,  К и с е л е-
в а  М.И.,  К о л о м и е ц  Т.М.,  К о в а л е н к о  Е.Д. Использование фитопатологического и молекулярно-генетического методов для идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом. Генетика, 2007, 43(8): 1058-1064.
8. Г у л ь т я е в а  Е.И.,  С т о й к о  Г.В.,  А л п а т ь е в а  Н.В.,  Б а р а н о в а  О.А. Молекулярная идентификация генов устойчивости к бурой ржавчине у сортов мягкой пшеницы районированных в Российской Федерации. Тез. докл. II Всерос. конф. «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам. СПб, 2008: 122-124.
9. Д ж е н и н  С.В.,  Л а п о ч к и н а  И.Ф.,  Ж е м ч у ж и н а  А.И.,  К о в а л е н к о  Е.Д. Особенности генотипа устойчивости к бурой ржавчине образцов яровой мягкой  пшеницы с генетическим материалом Aegilopstriuncialis. Тез. докл. II Всерос. конф. «Современные проблемы иммунитета растений  к  вредным организмам. СПб, 2008: 127-129.
10. К л и м е н т ь е в а  О.Э. Устойчивость российских сортов мягкой пшеницы к бурой ржавчине и идентификация Lr-генов с использованием молекулярных маркеров. СПб, 2008.
11. M a i n s  E.B.,  J a c k s o n  H.S. Physiological specialization in leaf rust of wheat, PucciniatriticinaErikss. Phytopathology, 1926, 16: 89-120.
12. Т ы р ы ш к и н  Л.Г.,  К у р б а н о в а  П.М.Индукция экспрессии генов устойчивости взрослых растений к листовой ржавчине у проростков  пшеницы. Микол. и фитопатол., 2009, 43(1): 75-80.
13. F l o r  H.H. Current status of gene-for-gene concept. Phytopathology, 1971, 9: 275-296.
14. M c I n t o s h  R.A.,  Y a m a z a k i  Y.,  D e v o s  K.M.,  D u b c o v s k y  J.,  R o g e r s  W.J.,
A p p e l s  R. Catalogue of gene symbols for wheat. MACGENE 2003 (CD Version). User Manual.
15. F e u i l l e t  C.,  M e s s m e r  M.,  S c h a c h e r m a y r  G.,  K e l l e r  B. Genetical and physical haracterization of Lr1 leaf rust resistance locus in wheat (Triticum aestivum L.). Mol. Gen. Genet., 1995, 248: 553-562.
16. S c h a c h e r m a y r  G.,  F e u i l l e t  C.,  K e l l e r  B. Molecular markers for the detection of the wheat leaf rust resistance gene Lr10 in diverse genetic backgrounds. Mol. Breed., 1997, 3: 65-74.
17. N e u  C.,  S t e i n  N.,  K e l l e r  B. Genetic mapping of the Lr20-Pm1 resistance locus reveals suppressed recombination on chromosome arm 7AL in hexaploid wheat. Genome, 2002, 45: 737-744.
18. M a g o  R.,  S p i e l m e y e r  W.,  L a w r e n c e  G.J. Identification and mapping of molecular markers linked to rust resistance genes located on chromosome 1RS of rye using wheat-rye translocation lines. Theor. Appl. Genet., 2002, 104: 1317-1324.
19. S c h a c h e r m a y r  G.,  S i e d l e r  H.,  G a l e  M.D.,  W i n z e l e r  H.,  W i n z e l e r  M.,
K e l l e r  B. Identification and localization of molecular markers linked to the Lr9 leaf rust resistance gene of wheat. Theor. Appl. Genet., 1994, 88: 110-115.
20. P r i n s  R.,  G r o e n e w a l d  J.,  M a r a i s  G.,  S n a p e  J.,  K o e b n e r  R.AFLP and STS tagging of Lr19, a gene conferring resistance to leaf rust in wheat. Theor. Appl. Genet., 2001, 103: 618-624.
21. S c h a c h e r m a y r  G.,  M e s s e r  M.,  F e u i l e t  C. Identification of molecular markers linked to the Agropyron elongatum-derived leaf rust resistance gene Lr24 in wheat. Theor. Appl. Genet., 1995, 90: 982-990.
22. C h e l k o w s k i  J.,  G o l k a  L.,  S t e p i e n  L. Application of STS markers for leaf rust resistance genes in near-isogenic lines of spring wheat cv. Thatcher. J. Appl. Genet., 2003, 44: 323-338.

ABOUT DNA-MARKERS AS SOLE CRITERIA FOR POSTULATION OF Lr-GENES OF THE Triticum aestivum L. RESISTANCE TO Puccinia triticina Erikss.: CRITICAL ESSAY

L.G. Tyryshkin

By the use of phytopathological test the author investigated the presence of the Lr1, Lr10, Lr20, Lr26 и Lr34 genes of resistance to leaf rust in 44 variants of soft wheat, in which early the presence of this genes was postulated according to STS- or SSR-analysis. It was shown, that the absence of listed genes in 6, 18, 2 and 3 varieties denote the weak genetic linkage between DNA-markers and genes of resistance to disease. The analysis the data of literature is showing that the Lr9, Lr19 и Lr24 — effective genes of juvenile resistance — also not always are close linked with ob-tained to them STS markers.

Key words: wheat, leaf rust, genes for resistance, DNA markers.

Оформление электронного оттиска