Сельскохозяйственная биология, 2010, № 3, с. 63-70.

УДК 633.11:631.524.7:57.08

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЗЕРНА МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ SDS-СЕДИМЕНТАЦИЕЙ

В.П. НЕЦВЕТАЕВ^1,2, О.В. ЛЮТЕНКО¹, Л.С. ПАЩЕНКО¹, И.И. ПОПКОВА¹

На образцах озимой мягкой пшеницы урожая 2007-2008 годов сравнивали результаты оценки качества зерна с использованием отмывки клейковины из шрота и по седиментации стандартными и модифицированными авторами методами. Предложенные методики позволяют выделять формы с экстравысоким качеством клейковины зерна в коллекционном и гибридном материале.

Ключевые слова: ИДК-анализ, клейковина, мягкая пшеница, седиментация, дисульфидные связи.

Оценка качества зерна с помощью SDS-седиментации интенсивно используется в работах с твердой пшеницей (1-3). На мягкой пшенице большее распространение нашла седиментация в слабых растворах органических кислот — тест Зелени и его модификация по Пумпянскому-Созинову (4-6), но в последние годы в исследования с мягкой пшеницей все шире вводится SDS-седиментация.

Цель наших экспериментов заключалась в оценке качества зерна селекционных образцов мягкой пшеницы с использованием классических и модифицированного методов SDS-седиментации.

Методика. Объектами изучения были образцы озимой мягкой пшеницы конкурсного и предварительного испытания урожая 2007 (74 формы) и 2008 (68 форм) годов, включая районированные и проходящие государственное испытания сорта. Для ИДК-анализа (определение индекса деформации клейковины) зерно размалывали до шрота на мельнице МЛ-1 (тип Циклон, Россия), для седиментации получали муку на вальцовой мельнице Quadrumat® Junior («Brabender», Германия) в соответствии с рекомендациями (6).

SDS-седиментацию проводили в двух модификациях. В первой (SDS 1) за основу взяли методику А.И. Рыбалки (2001, личное сообщение). Для седиментации отбирали навеску муки (3,2 г), помещали в мерный цилиндр объемом 100 мл и добавляли 50 мл 2 % уксусной кислоты. Содержимое перемешивали покачиванием 30 с и отстаивали 5 мин при комнатной температуре. Затем приливали 50 мл раствора, содержащего 100 г SDS в 5 л 2 % уксусной кислоты. Смесь повторно перемешивали покачиванием 10 с, отстаивали 5 мин и проводили первый учет набухаемости (мл). Процедуру повторяли (взбалтывали 10 с, отстаивали 5 мин), выполняли второй учет и определяли средний показатель. Во втором варианте (SDS 2) для оценки набухаемости (седиментации) после разрушения дисульфидных связей в белковых агрегатах к навеске муки 6 г в мерный цилиндр объемом 100 мл добавляли 1 % раствор сульфита натрия (Na2SO3), перемешивали в течение 30 с и отстаивали 30 мин, добавляли 50 мл раствора, содержащего 100 г SDS в 5 л 4 % уксусной кислоты. Опять перемешивали покачиванием 10 с, отстаивали 5 мин и учитывали показатель седиментации. Процедуру повторяли и рассчитывали средний показатель.

Седиментацию по Пумпянскому-Созинову (макрометод; 2 % раствор уксусной кислоты, навеска 3,2 г, объем мерного цилиндра — 100 мл) выполняли, как описано (6).

Стандартное определение качества клейковины с отмывкой из шрота проводили по прописи А.А. Созинова и соавт. (6). В модифицикации В.П. Нецветаева с соавт. (7, 8) шрот замачивали в растворе уксусной кислоты (0,05 М или 0,20 М, соответственно I и II вариант): в фарфоровой ступке при температуре 18±2 °С замешивали тесто шпателем, скатанный шарик помещали в ступку или чашку, закрывали крышкой и оставляли на 20 мин, после чего отмывали клейковину под слабой струей воды при той же температуре над мучным ситом (шелковым № 38 или капроновым № 49); отделившиеся кусочки клейковины собирали с сита и объединяли в общую пробу. Отмытую клейковину отжимали до состояния, когда она начинала слегка прилипать к рукам, взвешивали с точностью до 0,1 г, еще раз промывали 2-3 мин, повторно отжимали и взвешивали. Если разница показателей не превышала ±0,1 г, отмывку считали законченной. После оценки количества и качества сырой клейковины ее помещали на листике бумаги в сушильный шкаф на 4 ч при 105 °С. Количество сырой и сухой клейковины выражали в процентном отношении к массе навески измельченного зерна.

Качество сырой клейковины определяли на приборе ИДК-1 (Россия) в соответствии с инструкцией; перед работой прибор калибровали. От отмытой и взвешенной клейковины отделяли навеску 4 г, обминали 3-4 раза, сформированный шарик сначала помещали на 15 мин в чашку с водой при 18±2 °С, затем на столик прибора и подвергали воздействию деформирующей нагрузки в течении 30 с.  

Для дисперсионного анализа данных использовали программу СтатНов (9). Корреляционный анализ и определение других статистических показатели выполняли в программе Statistica 6.0.

Результаты. Как известно (10-13), технологические свойства муки (зерна) определяются качеством белка, которое прежде всего обусловлено сортовыми особенностями запасных белков зерновки, то есть наследственными вариантами белковых молекул эндосперма. Физико-химические свойства теста зависят от структуры белковых молекул и их способности образовывать межмолекулярные агрегаты (в значительной мере — за счет межмолекулярных дисульфидных связей, чему способствуют кислые условия среды). По числу и характеру этих связей (внутрицепочечные, межцепочечные) белковые комплексы эндосперма зерновки разных сортов не идентичны. В присутствии восстанавливающих агентов, например β-меркаптоэтанола, дитиотриэтола или сульфита натрия (Na2SO3), происходит дезагрегация вследствие разрушения межмолекулярных дисульфидных связей. Щелочная среда способствует интенсификации этого процесса.

При седиментации по Зелени и в варианте SDS 1 набухание муки происходит в кислой среде, где агрегация полипептидов усиливается. Это подтверждается сравнением результатов стандартного и модифицированного (I вариант) методов определения качества клейковины (табл. 1). Поскольку, например, поражение зерна клопом-черепашкой приводит к разжижению клейковины и, соответственно, увеличению показателя ИДК, для оценки ее физических свойств целесообразно использовать предлагаемый нами модифицированный метод отмывки, позволяющий снизить эффект ненаследственных факторов, включая влияние ферментов клопа-черепашки.

Кислые условия (см. табл. 1) способствовали существенному укреплению (ИДК-показатель) и уменьшению влагоемкости клейковины. Отметим, что исследуемые образцы были поражены клопом-черепашкой в разной степени (0,1-3,0 %, в среднем по опыту — 1,2 % зерен). В результате при стандартной оценке получены более высокие значения (среднее — 96,1±0,8 ед. ИДК), чем при использовании модифицированного метода (среднее — 80,8±1,2 ед. ИДК), что свидетельствует о разжижении клейковины под действием протеаз вредителя. Более детальный анализ качества клейковины у мягкой пшеницы, пораженной клопом, представлен ранее (7, 8). Корреляционный анализ выявил значительную связь между показателями седиментации, полученными по Пумпянскому-Созинову и методом SDS 1. Более того, показатели деформации клейковины (ИДК), измеренные стандартным методом, не коррелировали с результатами седиментации по Пумпянскому-Созинову и в варианте SDS 1, в то время как использованный модифицированный метод такую корреляцию демонстрировал (табл. 2). Следовательно, кислые условия седиментации нивелируют изменения набухаемости муки, вызванные поражением образцов клопом-черепашкой (см. табл. 2, 3). Характерно, что мы не обнаружили связь между степенью поражения этим вредителем и показателями качества зерна, полученными модифицированным методом, а также седиментацией по Пумпянскому-Созинову и SDS 1. Следовательно, эти условия целесообразно использовать для характеристики наследственных свойств зерна, поскольку влияние средовой изменчивости на результаты уменьшается.

Добавление к шроту (муке) восстанавливающих агентов должно приводить к деструкции клейковинного комплекса. Действительно, в варианте с сульфитом даже в кислых условиях клейковину не удавалось отмыть — образовывалась липкая масса. Учитывая такое воздействие восстанавливающих агентов на белковый комплекс, провели сравнение показателей набухаемости муки, определенных методами SDS 1 и SDS 2. Разница в этих показателях, по-видимому, может характеризовать число межмолекулярных дисульфидных связей в клейковинном комплексе.

На первом этапе обработки по методу SDS 2 (получасовая инкубация навески муки в растворе сульфита натрия) наблюдали дифференциацию образцов по набухаемости. Анализ выявил слабую отрицательную корреляцию этого показателя на промежуточном этапе определения со степенью поражения зерна клопом-черепашкой (r = -0,31±0,17; n = 34, 2008 год). Следовательно, в водном растворе сульфита натрия протеолитические ферменты клопа активны, способны разрушать пептидные связи и могут обусловливать около 10 % изменчивости этого показателя. На втором этапе (окончательная оценка) такой связи не обнаружили (см. табл. 3). В то же время наблюдалась существенная положительная корреляция между показателем SDS 2 седиментации и количеством сырой, а также сухой клейковины. Характерно, что этот метод седиментации давал результаты, отличные от полученных другими седиментационными методами (см. табл. 3). Следовательно, SDS 2 седиментация зависит от содержания клейковины в зерне пшеницы (увеличение количества белковых молекул должно повышать набухаемость вследствие агрегации, не зависящей от дисульфидных связей). Дифференциация по величине осадка несущественно коррелировала с физическими свойствами клейковины (см. табл. 3), чем подтверждается роль межмолекулярных бисульфидных связей в формировании клейковинного комплекса. В целом полученные данные свидетельствуют, что величина осадка, определяемая другими методами седиментации (по Зелени, Пумпянскому-Созинову, SDS 1), прежде всего обусловлена белками, содержащими цистеиновые остатки. Поэтому методы дают результаты, которые согласуются между собой и с показателями оценки физических свойств клейковины.

Наиболее информативен для определения физических свойств клейковины метод SDS 1 (см. табл. 3, 4). Показатели седиментации в уксусной кислоте (по Пумпянскому-Созинову) коррелировали с натурой зерна (см. табл. 3). Характерно, что в 2008 году отмечали слабую, но существенную связь между крупностью зерна и степенью его поражения клопом-чере-пашкой. Подтверждена также сопряженность между индексом деформации клейковины и количеством сырой и сухой клейковины (см. табл. 3, 4).

Для оценки относительного содержания цистеиновых остатков (Ц), участвующих в агрегации полипептидов, на основании показателей седиментации, полученных методами SDS 1 и SDS 2, можно разность этих показателей (SDS 1 - SDS 2) разделить на количество сухой клейковины или белка, выраженное в процентах.  

Анализ показал существенную отрицательную связь между Ц и ИДК, количеством сухой и сырой клейковины (см. табл. 3), но не выявил корреляцию со степенью поражения зерна клопом-черепашкой, массой зерна и его натурой. Образцы сортов Селянка одесская и Уни 1 характеризовались наиболее высокими показателями Ц (6,52 и 6,11). Селянка одесская, по данным одесских исследователей, относится к суперсильным пшеницам (14). Такого типа сорта известны, описаны причины их высокого качества. Так, Red River несет тандемную дупликацию аллеля Glu-B1al, контролирующего синтез высокомолекулярных глютелинов, которые участвуют в агрегации белковых молекул за счет дисульфидных связей (10, 11). Сорт Bànkúti 1201 несет аллель Glu-1Ах2*b (15) с замещенным основанием в положении 1181, что приводит к замене аминокислоты серина на цистеин в молекуле глютелина. Появление дополнительного остатка цистеина приводит к повышению степени агрегации, что улучшает физические качества

клейковины и хлебопекарные показатели муки. Характерно, что по молекулярной массе и заряду мутантный белок, контролируемый аллелем Glu-1Ах2*b, при электрофорезе не удается отличить от белка дикого типа (аллель Glu-1Ах2*).

Образец Уни 1 интересен отсутствием в эндосперме ω-глиадинов, контролируемых хромосомой 1D (12). Эти белки вообще не содержат цистеин. Соответственно, доля других полипептидов в эндосперме зерновки увеличивается, что приводит к повышению качества муки по сравнению с таковым у исходных форм. Отсутствие этой группы глиадинов легко тестируется с помощью электрофореза.

Из изученных образцов наименьший показатель Ц (табл. 5) имел сорт Синтетик, несущий 1B.1R транслокацию. Хромосома 1R ржи контролирует синтез запасных белков эндосперма — секалинов. Известно, что белки ржи, которые синтезируются у пшеницы, негативно влияют на хлебопекарные качества муки пшеницы (13) из-за неспособности секалинов образовывать с белками пшеницы нерастворимые высокополимерные белковые комплексы, формирующие клейковину с высокими физическими показателями качества (16). Таким образом, наличие белков ржи в эндосперме пшеницы уменьшает число межмолекулярных дисульфидных связей. Другой сорт с ржаной транслокацией, но в 1А хромосоме (1AL.1RS) — Богданка. Характерно, что этот сорт также имеет более низкий показатель Ц (0,94) (см. табл. 5), который, однако, выше, чем у образца Синтетик. Следовательно, степень снижения качества муки пшеницы может зависеть от того, в какую из гомеологичных хромосом (1A, 1B или 1D) транслоцировано плечо 1RS.

Как известно, ген мягкозерности (Soft) по сравнению с геном твердозерности (hard) приводит к значительному снижению набухаемости муки, что связано не с клейковинными белками, а крахмальным комплексом (17). Действительно, у сорта озимой мягкой пшеницы Волжская 100, которая относится к мягкозерным, в отличие от остальных представленных (см. табл. 5) в 2008 году показатель SDS 1 седиментации и седиментации по Пумпянскому-Созинову составил соответственно 51,0 и 23,5 мл при среднем по опыту соответственно 68,2 и 29,8 мл. Следовательно, мягкозерность снижала эти показатели на 22-25 %. Таким образом, Ц у сорта Волжская 100 (2,78), по-видимому, корректно характеризует количество межмолекулярных дисульфидных связей в запасных белках эндосперма.

Поскольку для установления Ц требуется выполнить достаточно трудоемкую процедуру определения количества белка или сухой клейковины в зерне, мы провели корреляционный анализ между величиной Ц и разницей (Δ) показателей седиментации в вариантах SDS 1 и SDS 2 для 68 образцов и получили r = 0,9847±0,0214 (t = 45,96). Коэффициент детерминации между этими показателями составляет 96,97 %. Следовательно, для массовой оценки качества достаточно исследовать у образцов показатели седиментации в вариантах SDS 1 и SDS 2. Так, для форм с ржаной транслокацией 1BL.1RS и 1AL.1RS Δ составляла соответственно -2,7 и +8,3 мл, для эктрасильных образцов — 54,8-63,5 мл. Интересно отметить, что у образца 252/08, полученного от скрещивания сортов Белгородская 12 и Селянка одесская, величина Ц равнялась 7,06, то есть показателю, соответствующему таковому у родительской формы Селянка одесская (см. табл. 5). По данным ИДК-анализа, в течение 2 лет (2007-2008) у этого образцаформировалась клейковина I группы качества, что подтверждает ее высокие показатели.

Итак, учитывая различные причины, приводящие к увеличению числа межмолекулярных дисульфидных мостиков, а также затруднения при электрофоретической идентифицикации необходимых вариантов полипептидов, очевидна роль разработки комплексных подходов к их количественной оценке. Относительная оценка содержания межмолекулярных дисульфидных связей (Ц), полученная с помощью предложенных модификаций метода SDS-седиментации, на наш взгляд, дает результирующий показатель качества клейковины, связанного с наличием в эндосперме цистеинсодержащих полипептидов. Этот подход может использоваться для выявления среди коллекционного материала и гибридного потомства форм с большим количеством межмолекулярных дисульфидных связей.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. D i c k  J.W.,  Q u i c k  J.S. A modified screening test for rapid estimation of gluten strength in early-generation durum wheat breeding lines. Cereal Chemistry, 1983, 60(4): 315-318.
2. К а з а к о в  Е.Д. Методы оценки качества зерна. М., 1987.
3. В а с и л ь ч у к  Н.С. Селекция яровой твердой пшеницы. Саратов, 2001: 63-66.
4. Z e l e n y  L. Wheat sedimentation test. Cereal Science Today, 1962, 7(7): 226-230.
5. П у м п я н с к и й  А.Я. Технологические свойства мягких пшениц. Л., 1971.
6. С о з и н о в  А.А.,  Б л о х и н  Н.И.,  В а с и л е н к о  И.И.,  С и н и ц и н С.С.,  К о м а р о в  В.И., Т а р а с е н к о  Н.Д.,  К р а в ц о в а  Б.Е. Методические рекомендации по оценке качества зерна. М., 1977.
7. Н е ц в е т а е в  В.П.,  М о т о р и н а  И.П.,  П е т р е н к о  А.В. Сравнение методов определения качества клейковины зерна мягкой пшеницы на приборе ИДК-1. Докл. РАСХН, 2005, 4: 14-16.
8. Н е ц в е т а е в  В.П.,  Ч у б а р е в а  М.В.,  П е т р е н к о  А.В. Оценка качества клейковины пшеницы при поражении зерна вредным клопом-черепашкой. Мат. Межд. науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы аграрной науки и образования». Т. 1. Агрономия и агроэкология. Ульяновск, 2008: 114-118.
9. СтатНов. Система статистического анализа ВИУА. М., 1991.
10. D’O v i d i o  R.,  M a s c i  S.,  P o r c e d d u  E.,  K a s a r d a  D. Duplication of the Bx7 high-molecular-weight glutenin subunit gene in bread wheat (Triticum aestivum L.) cultivar Red River 68. Plant Breed., 1997, 116: 525-531.
11. B u t o w  B.,  G a l e  K.,  I k e a  J.,  J u h a s z  A.,  B e d o  Z.,  
T a n a s  L.,  G i a n i b e l l i  M. Dissemination of the highly expressed Bx7 glutenin subunit (Glu-B1al allele) in wheat as revealed by novel PCR markers and RP-HPLC. Theor. Appl. Genet., 2004, 109: 1525-1535.
12. К о п у с ь  М.М. Полиморфизм белков зерна и селекция озимой пшеницы. Автореф. докт. дис. Краснодар, 1998.
13. Z e l l e r  F.,  G u n z e l  G.,  F i s c h b e c k  G.,  G e r s t e r n k o r n  P.,  W e i p e r t   D. Veranderung der Backeigenschaften der Weizen-Roggen Chromosomen-Translocation 1B/1R. Getreide Mchl. Brot., 1982, 36: 141-143.
14. Л и т в и н е н к о  М.А.,  Л и ф е н к о  С.П.,  Л i н ч е в с ь к и й  А.А.,  П а л а м а р-
ч у к  А.I.,  М а к с и м о в  М.Г.,  Ч а й к а  В.Г. Каталог нових сортiв зернових колосових культур Селекцiйно-генетичного iнституту. Одесса, 2000.
15. J u h a s z  A.,  T a m a s  L.,  K a r s a i  I.,  V i d a  G.,  L a n g  L.,
 B e d o  Z. Identification, cloning and characterization of a HMW-glutenin gene from an old Hungarian wheat variety, Bànkúti 1201. Euphytica, 2001, 119: 75-79.
16. Р ы б а л к а  А.И.,  К а з а р д а  Д.Д.,  С о з и н о в  А.А. R-глиадины — проламины ржи, синтезирующиеся в эндосперме пшеницы. С.-х. биол., 1985, 2: 34-42.
17. К о п у с ь  М.М. Влияние особенностей компонентного состава глиадина, консистенции эндосперма на качество муки у гибридов от скрещивания сортов пшеницы Безостая 1 и Восход. Науч.-техн. бюлл. ВСГИ, 1982, 1(43): 35-39.

ESTIMATION OF GRAIN QUALITY IN SOFT WHEAT VARIANTS BY SDS-SEDIMENTATION

V.P. Netsvetaev^1,2, O.V. Lyutenko¹, L.S. Pashchenko¹, I.I. Popkova¹

On the variants of a winter soft wheat harvest of 2007-2008 years the authors compare the results of estimation of grain quality on gluten wash and sedimentation by standard and own modified methods. The presented techniques permit to isolate the forms with extra-high quality of grain gluten in collection and hybrid material.

Key words: IDK-analysis, gluten, Triticum aestivum, sedimentation tests, disulfide bonds.

Оформление электронного оттиска