doi: 10.15389/agrobiology.2024.2.385rus
УДК 636.085.57:579.6
Исследование частично проведено на оборудовании ЦКП ФИЦ Биотехнологии РАН. Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия инновациям по программе УМНИК-21 (Черкизово) № 17035ГУ/2021 от 15.06.2021.
НОВЫЕ ШТАММЫ Bacillus licheniformis, ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ
И ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРИ ПЕРЕРАБОТКЕ ПЕРА
В КОРМОВУЮ ДОБАВКУ
К.Э. БЕТЕХТИН1 ✉, О.И. САЗОНОВА2, С.Л. СОКОЛОВ2, Л.И. КОВАЛЕВ3, М.А. КОВАЛЕВА3, Н.Г. МАШЕНЦЕВА1, А.Н. НЕРЕТИНА4
Биодеградация кератина пера сельскохозяйственной птицы микроорганизмами, обладающими кератинолитической активностью, представляет альтернативный привлекательный метод повышения питательной ценности отходов и предотвращения загрязнения окружающей среды. Кератинолитические протеазы используются для получения редких аминокислот — пролина, серина и цистеина. Бактериальный гидролизат перьев можно применять в качестве ингредиента корма для животных или органического удобрения, благодаря чему снижается воздействие отходов птицеводства на окружающую среду. В настоящей работе впервые установлено, что при переработке пера цыплят-бройлеров штаммом Bacillus licheniformis БАЛ-2, который использует перо в качестве единственного источника углерода, свободный кератин полностью превращается в перевариваемые пептиды и незаменимые аминокислоты. Цель работы заключалась в изучении морфологических, физиолого-биохимических и молекулярно-генетических свойств штаммов Bacillus licheniformis БАЛ-1 и БАЛ-2, их идентификации и использования для ферментации пера цыплят-бройлеров. Штаммы Bacillus licheniformis БАЛ-1 (ВКПМ В-14243) и БАЛ-2 (ВКПМ В-14244) — природные изоляты, выделенные из донных отложений Финского залива Балтийского моря (д. Кандикюля). Куриное перо цыплят-бройлеров кросса Ross 308 (Птицеперерабатывающий комплекс «Константиново», ПАО «Группа Черкизово», с. Константиново, Московская обл., Раменский р-н) поступило с промышленной линии ощипывания птицы, имело включения крови, влажность 75 % и подвергалось ферментации через 24 ч после получения. Морфотипы колоний B. licheniformis определяли на триптон-соевом агаре. Геномную ДНК бактерий выделяли с использованием набора реагентов («Thermo Scientific», Литва). Фрагмент 16S рДНК амплифицировали в ПЦР со специфичными праймерами для гена 16S рРНК эубактерий: 8f 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' и 1492r 5'-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3'. Идентичность нуклеотидных последовательностей анализировали с помощью программы BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Для ферментации пера в колбу, содержащую 100 см3 минерально-питательной среды, помещали 5 г измельченного пера птицы. Штамм B. licheniformis БАЛ-1 или БАЛ-2 вносили в минеральную среду до конечной концентрации 1×106 КОЕ/см3. Ферментацию пера проводили в течение 72 ч при 28 °С и постоянном перемешивании. В культуральной жидкости определяли кератиназную активность с использованием суспензии кератина. Раствор фермента (1 см3) добавляли к суспензии кератина (1 см3) в реакционном буфере. После 1 ч инкубации при 37 °C реакцию останавливали добавлением 2 см3 5 % ТХУ и раствор фильтровали. Ферментированное перо исследовали методом растровой электронной микроскопии. Двумерный гель-электрофорез выполняли по О’Фарреллу c изоэлектрофокусированием в амфолиновом градиенте pH (IEF-PAGE); белки детектировали последовательным окрашиванием кумасси голубым R-250 и азотнокислым серебром. При подготовке препаратов для 2D электрофореза 100 мг измельченного образца гомогенизировали в 2 см3 лизирующего раствора. Гомогенат осветляли центрифугированием, фракцию супернатанта, содержащую экстракт белков, использовали для разделения в равных нанесениях по 50-75 мкл. После трипсинолиза белковые фракции идентифицировали с помощью MALDI-TOF MS/MS масс-спектрометрии (масс-спектрометр Ultraflex, «Bruker Daltonics GmbH & Co. KG», Германия) с УФ-лазером (l = 336 нм) в режиме детекции положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да. Тонкослойную бумажную хроматографию проводили по ГОСТ 28366-89. Содержание общего азота в высушенном пере после ферментации оценивали методом Кьельдаля. Геномный фингерпринт осуществляли методом rep-ПЦР с праймерами Rep1R-I и Rep2-I ERIC-PCR (набор праймеров ERIC1R и ERIC2), ERIC2-PCR c праймером ERIC2, BOX-PCR c праймером BOX A1R и (GTG)5-PCR с праймером (GTG)5. Для подготовки ДНК-матриц по одной колонии культур микроорганизмов отбирали, суспендировали в 20 мкл деионизированной воды и обрабатывали в микроволновой печи в течение 2 мин на максимальной мощности. Полученные препараты хранили при -20 °С и размораживали перед использованием в ПЦР. По результатам анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК было установлено, что штаммы БАЛ-1 и БАЛ-2 принадлежат виду Bacillus licheniformis. Штаммы способны расти на минеральной среде с куриным пером как единственным источником углерода до концентрации 1×108 КОЕ/см3. При высеве аликвот из разных разведений выявили 16 мор-фотипов колоний. Для штамма B. licheniformis БАЛ-1 обнаружено 10 морфотипов, для B. licheniformis БАЛ-2 — 6 морфотипов. Методом геномного фингерпринта на основе ПЦР подтверждена сохранность выявленных морфотипов штаммов. Кератиназная активность штамма B. licheniformis БАЛ-1 составила 16,2±0,3 КА/см3, штамма B. licheniformis БАЛ-2 — 18,3±0,2 КА/см3. Методами двумерного гель-электрофореза и масс-спектрометрической идентификации показана способность кератиназ B.licheniformis превращать неусвояемый кератин куриного пера в перевариваемые пептиды в результате полного разложения свободного кератина при ферментации штаммом БАЛ-2 и частичного под действием штамма БАЛ-1. Методом растровой электронной микроскопии был выявлен гидролиз пера кератиназными ферментами B. licheniformis, доказано полное разложение бороздок пера и нарушение структуры перьевого стержня. Методом тонкослойной хроматографии показано присутствие лизина, треонина, метионина, валина, фенилаланина в ферментате пера. Содержание азота в пересчете на сухое вещество в образце с B. licheniformis БАЛ-1 составило 72,41 %, с B. licheniformis БАЛ-2 — 76,38 %, то есть образец с B. licheniformis БАЛ-2 содержал большее количество микробного белка. Результаты проведенных исследований показывают перспективность применения штамма B. licheniformis БАЛ-2 для ферментации пера с целью использования в качестве кормовой добавки для бройлеров.
Ключевые слова: кератинсодержащее сырье, переработка пера, кератиназы, Bacillus licheniformis.
K.E. Betekhtin1 ✉, O.I. Sazonova2, S.L. Sokolov2, L.I. Kovalev3,
M.A. Kovaleva3, N.G. Mashentseva1, A.N. Neretina4
Feather waste biodegradation by keratinolytic microorganisms is an alternative to convert feather into nutritionally valuable feed additives and an attractive way to prevent environmental pollution. Cytolytic proteases are used to produce rare amino acids (proline, serine and cysteine). Bacterial hydrolysate of feathers can serve as an ingredient in animal feed or as an organic fertilizer, thereby reducing the impact of poultry waste on the environment. In this work, for the first time, it was found that with this method of pen processing by the Bacillus licheniformis BAL-2 strain, which uses the feather as the only carbon source, free keratin is completely converted nto digestible peptides and essential amino acids. The aim of the work is to study the morphological, physiological-biochemical and molecular-genetic properties of Bacillus licheniformis strains BAL-1 and BAL-2, their identification and use for fermentation of broiler chicken feathers. Bacillus licheniformis strains BAL-1 (VKPM B-14243) and BAL-2 (VKPM B-14244) are natural isolates from sediments of the Gulf of Finland of the Baltic Sea, Kandikul village. Ross-308 chicken feather (PJSC Cherkizovo Group Poultry Processing Complex Konstantinovo, Moscow Province, Ramenskoye District, Konstantinovo village) obtained from an industrial bird plucking line, had blood inclusions, humidity 75 % and was used for fermentation 24 hours after delivery. The morphotypes of B. licheniformis colonies were determined on Trypton soybean agar. The genomic DNA was isolated using a GeneJET Genomic DNAPurification Kit («Thermo Scientific», Lithuania). The 16S rDNA fragment was amolified by PCR with primers specific to the 16S rRNA genes of eubacteria: 8f 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' and 1492r 5'-TACGGHTACCTTGTTACGACTT-3'. The analysis of the identity of nucleotide sequences was performed using the BLASTN program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Feather (5 g) was added to a flask with 100 cm3 of mineral-nutrient medium. B. licheniformis BAL-1 or BAL-2 was introduced into the mineral medium to a final concentration of 1×106 CFU/cm3. Fermentation was carried out for 72 hours at 28 °C and constant stirring. Keratinase activity was determined in the culture fluid using a keratin suspension. The enzyme solution (1 cm3) was added to the keratin suspension (1 cm3) in the reaction buffer. After 1 hour of incubation at 37 °C, the reaction was stopped by adding 2 cm3 of 5 % TCA and the solution was filtered. The fermented feather was examined by scanning electron microscopy. Two-dimensional gel electrophoresis was performed according to O’Farrell’s procedure with isoelectrofocusing in the ampholine pH gradient (IEF-PAGE); proteins were detected by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250 and silver nitrate. For 2D electrophoresis, 100 mg portion of the crushed feather was homogenized in 2 cm3 of the lysing solution. The homogenate was clarified by centrifugation, the supernatant fraction containing protein extract was used for fractioning in equal applications of 50-75 µl. After trypsinolysis, protein fractions were identified by MALDI-TOF and MS/MS mass spectrometry (Ultraflex mass spectrometer, Bruker Daltonics GmbH & Co. KG, Germany) with a UV laser (l = 336 nm) in the detection mode of positive ions in the mass range 500-8000 Da. Thin-layer paper chromatography was performed according to GOST 28366-89. The total nitrogen content in the dried feather after fermentation was evaluated by the Kjeldahl method. Genomic fingerprint was carried out by rep-PCR with primers Rep1R-I and Rep2-I ERIC-PCR (a set of primers ERIC1R and ERIC2), ERIC2-PCR, the primer ERIC2, BOX-PCR, the primer BOX A1R, and (GTG)5-PCR, the primer (GTG)5. To prepare DNA matrices, individual colonies were selected, suspended in 20 µl of deionized water, and processed for 2 minutes in a microwave oven at maximum power. The resulting preparations were stored at 20 °C, then thawed and used in PCR. According to the results of the analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene, it was found that the strains BAL-1 and BAL-2 belong to the species Bacillus licheniformis. The strains are able to grow up to 1×108 CFU/cm3 on a mineral medium with chicken feather as a single carbon source. By serial dilutions, 16 morphotypes of colonies were identified, 10 for B. licheniformis BAL-1, and 6 for B. licheniformis BAL-2. The preservation of the identified morphotypes in culture fluid was confirmed by PCR-based genomic fingerprint. The keratinase activity of B. licheniformis BAL-1 was 16.2±0.3 KA/cm3, of BAL-2, 18.3±0.2 KA/cm3. The ability of B. licheniformis keratinases to convert indigestible chicken feather keratin into digestible peptides occurred due to a complete decomposition of free keratin by BAL-2 strain and partial decomposition by BAL-1 strain. It was shown by 2D electrophoresis and mass spectrometric identification. Hydrolysis of the feather by keratinase enzymes was visualized by scanning electron microscopy. B. licheniformis completely decomposed the grooves and destructed feather rod. The presence of lysine, threonine, methionine, valine, and phenylalanine in the hydrolysate was confirmed by thin-layer chromatography. The nitrogen content for B. licheniformis BAL-1 was 72.41 % DM, for B. licheniformis BAL-2 76.38 % DM. Our findings show the prospects for the use B. licheniformis BAL-2 for feather fermentationto produce a feed additive for broilers.
Keywords: keratin-containing raw materials, feather processing, keratinase, Bacillus licheniformis.
1ФГБОУ ВО Российский биотехнологический |
Поступила в редакцию |
