БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАК ПОДАТЬ РУКОПИСЬ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

 

 

 

 

doi: 10.15389/agrobiology.2019.2.359rus

УДК 619:578:616.5:57.083.2:577.2

Работа выполнена за счет средств гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых № МК-2090.2018.11.

 

ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА ВИРУСА ЧУМЫ
МЕЛКИХ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР В РЕАЛЬНОМ
ВРЕМЕНИ

Н.И. САЛЬНИКОВ, С.П. ЖИВОДЕРОВ, Д.В. ЯНЖИЕВА, А.Ю. КОЛЬЦОВ,
Т.Р. УСАДОВ, М.М. СУХЕР, Ю.П. МОРГУНОВ, А.В. ЛУНИЦИН

Чума мелких жвачных животных (ЧМЖЖ) — высококонтагиозная трансграничная инфекционная болезнь мелких жвачных, характеризующаяся лихорадкой, анорексией, истечениями из глаз и носа, эрозиями и язвами в слизистой оболочке пищеварительного тракта, диареей, а также лейкопенией с иммуносупрессией. Ввиду сложной эпизоотической обстановки по ЧМЖЖ в сопредельных с Российской Федерацией государствах (Таджикистан, Китай, Монголия, Казахстан, Афганистан) существует высокий риск проникновения данного заболевания на территории Сибирского, Уральского, Дальневосточного, Северо-Кавказского и Южного федеральных округов. В связи с этим необходимы методы молекулярно-генетической диагностики возбудителя ЧМЖЖ, а также способы стабилизации образцов биоматериала для диагностических исследований при транспортировке на дальние расстояния. Нами представлены данные по разработке тест-системы для выявления генома вируса ЧМЖЖ методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Методика основана на амплификации фрагмента гена гемагглютинина размером 148 п.н. с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров, а также флуоресцентно меченного гибридизационного зонда. Аналитическую специфичность разработанной тест-системы оценивали при исследовании панели образцов биоматериала, содержащих штаммы вируса ЧМЖЖ, чумы крупного рогатого скота, блютанга, а также образцов биоматериала от клинически здоровых животных и интактных культур клеток. При этом положительные результаты получены только при исследовании образцов, содержащих штаммы вируса ЧМЖЖ (Эпизоотический, Nigeria 75/1 и 45G37/35-K). Аналитическая чувствительность разработанной тест-системы, определенная с использованием последовательных 10-кратных разведений культурального вирусосодержащего материала, составила 0,83±0,22 lg ТЦД50/см3. Положительным контролем амплификации в разработанной тест-системе служил фрагмент гена гемагглютинина вируса ЧМЖЖ, который клонировали в составе плазмидного вектора pTZ57 R/T в клетках Escherichia coli. Установлено, что линейность амплификации в диапазоне концентраций плазмидной ДНК от 2,4×107 до 24 молекул в 1 мкл. Для оценки практической пригодности разработанной тест-системы исследовали образцы крови, отобранные от овец, экспериментально инфицированных штаммом Эпизоотический вируса ЧМЖЖ. В результате геном вируса ЧМЖЖ был выявлен в пробах крови, отобранных с 5-х по 12-е сут после заражения. Для транспортировки образцов биоматериала на дальние расстояния нами предложена методика «сухой» капли для отбора и хранения проб крови на бумажном носителе. Показано, что такие препараты стабильны при комнатной температуре в течение 1 мес и могут быть использованы для исследований методом ОТ-ПЦР в реальном времени.

Ключевые слова: чума мелких жвачных животных, вирус, культура клеток, обратная транскрипция, ПЦР, рекомбинантная плазмида, экспериментальная инфекция.

 

 

TEST-SYSTEM FOR DETECTION OF PESTE DES PETITS RUMINANTS VIRUS GENOME BY REVERSE TRANSCRIPTION REAL-TIME PCR

N.I. Salnikov, S.P. Zhivoderov, D.V. Yanzhieva, A.Yu. Koltsov,
T.R. Usadov, M.M. Suher, Yu.P. Morgunov, A.V. Lunitsyn

Peste des petits ruminants (PPR) is a highly contagious transboundary infection disease of small ruminants, characterized by fever, anorexia, ocular and nasal discharge, erosions and ulcers in digestive mucosa, diarrhoea and marked leucopoenia with immunosuppression. Because of the complexity of the PPR epizootic situation in neighboring countries (Tajikistan, China, Mongolia, Kazakhstan, Afghanistan) the risk of occurrence of this disease on the territories of Siberian, Ural, Far Eastern, North Caucasian and Southern Federal Districts of Russian Federation is very high. So, the development of molecular-genetic methods for the diagnosis of PPR and methods for stabilizing of biological samples represents scientific relevance. This article presents data on the development of a test system for detecting the PPR virus genome by reverse transcription Real-Time PCR. This technique is based on the amplification of a fragment (148 bp) of hemagglutinin gene of PPR virus using the original oligonucleotide primers and fluorescent-labeled hybridization probe. Analytical specificity of the developed test system was evaluated by testing the strains of PPR virus, rinderpest virus, bluetongue virus, as well as biological samples from clinically healthy animals and intact cell cultures. Positive results were obtained only with samples containing PPR virus (strains Epizootichesky, Nigeria 75/1 and 45G37/35-K). The analytical sensitivity of the developed test-system, determined using tenfold serial dilutions of cultural virus-containing material, is 0.83±0.22 lg TCID50/ml. To create a positive amplification control, a fragment of hemagglutinin gene synthesized usign Real-Time PCR was cloned in plasmid pTZ57 R/T in Escherichia coli. It was established that the plasmid DNA concentration for amplification linearity ranges from 2.4×107 to 24 molecules/μl. To assess the practical suitability of the developed test system for the diagnosis of PPR, the blood samples from sheep experimentally infected with PPR virus (strain Epizootichesky) were tested. As a result, the PPR virus genome was detected in blood samples from day 5 to day 12 after infection. Since transportation of biological samples over long distances may require during survey, we have developed “dry” blood method to collect and store blood samples. It has been shown that “dry” blood drops are stable at room temperature for a month and can be used in Real-Time PCR testing.

Keywords: peste des petits ruminants, virus, reverse transcription, PCR, cell culture, recombinant plasmid, experimental infection.

 

ФГБНУ Федеральный исследовательский центр
вирусологии и микробиологии,

601125 Россия, Владимирская обл., Петушинский р-н,
пос. Вольгинский, ул. Академика Бакулова, стр. 1,
e-mail: nikolai.salnikov2010@yandex.ru ✉, zhivoderov-serg@mail.ru,darima.yanzhieva.90@mail.ru, kolcov.andrew@gmail.com, usadov.tr@mail.ru, suhermail@mail.ru, morgunovvv@mail.ru, lunicyn@mail.ru

Поступила в редакцию
27 ноября 2018 года

 

назад в начало

 


СОДЕРЖАНИЕ

 

 

Полный текст PDF

Полный текст HTML