Сельскохозяйственная биология, 2011, № 2, с. 63-67.

УДК 636.2:614.876:591.111.1:577.15

АКТИВНОСТЬ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ В ЛИМФОЦИТАХ И ТРОМБОЦИТАХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПРИ ДЕЙСТВИИ ВНЕШНЕГО γ-ИЗЛУЧЕНИЯ

Т.С. ШЕВЧЕНКО, И.В. КОНОПЛЕВА

У крупного рогатого скота черно-пестрой породы, подвергнутого воздействию тотального внешнего γ-излучения в дозе 3,5 Гр, обнаружили увеличение базальной и стимулированной простагландином Е1 компонент активности аденилатциклазы в лимфоцитах, а также значительное уменьшение этих показателей в тромбоцитах. При этом коэффициент стимуляции аденилатциклазы в тромбоцитах снижался.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, внешнее γ-облучение, лимфоциты, тромбоциты, система цАМФ, аденилатциклаза, коэффициент стимуляции аденилатциклазы.

Жизнедеятельность большинства клеток в организме млекопитающих контролируется универсальными системами регуляции метаболизма (мессенджерами) (1, 2). Основными внеклеточными регуляторами физиологических процессов служат гормоны, медиаторы, нейротрансмиттеры, важнейшими внутриклеточными — Са²⁺ и система циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) (1-3). Механизм цАМФ-зависимой гормональной регуляции можно описать следующим образом. Под влиянием гормонального сигнала, поступающего на соответствующие рецепторы, в цитоплазме клетки кратковременно повышается содержание вторичного мессенджера — цАМФ, который, в свою очередь, инициирует каскад реакций, приводящих к изменению метаболических процессов и формированию специфического клеточного ответа (1, 2).
Известно, что действие γ-излучения на млекопитающих приводит к изменению содержания катехоламинов, кортикостероидов, серотонина и других биологически активных соединений в тканях и периферической крови (4). Обнаружены также пострадиационные нарушения ряда параметров системы цАМФ в некоторых клеточных популяциях у лабораторных животных (5, 6), овец и лошадей (7-9). В то же время данные по исследованию ферментов системы цАМФ у крупного рогатого скота (КРС) практически отсутствуют, а экстраполяция результатов, полученных на других животных, для КРС представляется недостаточно правомочной, поскольку у жвачных имеются видовые отличия от остальных млекопитающих. Кроме того, у КРС в ответ на облучение можно ожидать проявление специфических индивидуальных реакций клеточных систем. 
Целью настоящей работы стало изучение активности ключевого фермента системы циклического аденозинмонофосфата — аденилатциклазы в наиболее радиочувствительных клетках периферической крови (лимфоциты и тромбоциты) у крупного рогатого скота, подвергнутого действию внешнего γ-облучения.
Методика. Крупный рогатый скот (КРС) черно-пестрой породы (29 гол.) содержали в условиях вивария Всероссийского НИИ радиологии и агроэкологии (г. Обнинск). Рацион животных был сбалансирован по основным питательным веществам согласно нормам Всероссийского НИИ животноводства (г. Москва). Животных из опытной группы (17 гол.) подвергали воздействию тотального внешнего γ-излучения в полулетальной дозе (3,5 Гр) при мощности дозы 1 Гр/ч на установке ГУЖ-24 (источник излучения — ¹³⁷Cs с энергией γ-квантов 0,67 МэВ) (Россия). Степень и равномерность облучения отслеживали с помощью дозиметра VAJ-18 (Германия) со сферической ионизационной камерой VАК-253 (Германия). Неравномерность γ-поля не превышала ±15 %. Контролем служили все животные до облучения и отдельная группа необлученного КРС (12 гол.) в течение 30 сут.
Кровь отбирали из яремной вены до и на 1-е, 3-и, 5-е, 7-е, 10-е, 15-е и 30-е сут после облучения. Антикоагулянтом служил цитрат натрия в конечной концентрации 0,38 %. Популяции тромбоцитов и лимфоцитов КРС выделяли разработанным нами способом (10). Изолированные клетки промывали 2 раза в растворе, содержащем NaCl, KCl, K₂HPO₄, MgCl₂, глюкозу и N-2-(гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (соответственно 145; 5; 0,5; 1; 3 и 10 мМ, рН 7,4). Подсчет клеток в полученных суспензиях проводили в камере Горяева, жизнеспособность оценивали в тесте с трипановым синим. Перед проведением ферментативной реакции аликвоту тромбоцитов замораживали, лимфоцитов — лизировали в гипотонической среде 30 мин при температуре 4 °С. Активность аденилатциклазы в лизатах клеток определяли по методике, описанной ранее (8). В качестве меченых субстратов использовали [14С]-АТФ и [3Н]-цАМФ («Amersham», Великобритания). Радиоактивность образцов подсчитывали с помощью жидкостно-сцинтилляционного счетчика SL-4220 («Intertechnique», Франция). Гормон-стимули-рованную компоненту активности аденилатциклазы определяли по разнице между ферментативной активностью с активатором (простагландин Е1) и без него. Коэффициент стимуляции аденилатциклазы рассчитывали по отношению величин стимулированной и базальной компонент активности.
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Exсel 2003. Различия значений признавали достоверными при р < 0,05.
Результаты. Жизнеспособность клеток в анализируемых популяциях лимфоцитов и тромбоцитов в тесте с трипановым синим составляла 90-95 %, что считается хорошим результатом при выделении клеточных популяций.
У клеток, находящихся «в покое» (при отсутствии стимулирующего или ингибирующего действия физиологически активных соединений), функционирование аденилатциклазы связано с каталитической субъединицей фермента. Это так называемая базальная компонента активности (1). В лимфоцитах у необлученного КРС она составляла 2,1±0,4 пмоль/мин x 10⁶ клеток, в тромбоцитах — 13,3±3,0 пмоль/мин x 10⁸ клеток. Величина активности фермента практически не изменялась в течение 30 сут. В лимфоцитах облученных животных на 1-е сут этот показатель превышал контроль в 4,33, на 3-и — в 3,76, на 5-е — в 4,29, на 10-е — в 3,57, на 30-е сут — в 2,74 раза (табл.). Базальная активность аденилатциклазы в тромбоцитах КРС на 1-е сут после воздействия g-излучения снижалась в 3,09 раза по сравнению с исходной. На 3-и-5-е сут регистрировали ее восстановление до контрольных значений. На 7-е сут она уменьшалась в 2,66, на 10-е — в 3,25, на 15-е — в 5,71 раза (см. табл.). 
Механизм цАМФ-зависимой гормональной регуляции клеточного метаболизма опосредуется через адренорецептор, встроенный в цитоплазматическую мембрану клетки, G-белок и аденилатциклазу. При неизменности двух первых составляющих трансдукция гормонального сигнала реализуется посредством повышения или ингибирования активности аденилатциклазы. В опытах на лабораторных животных в качестве активаторов обычно используют изопротеренол или простагландин Е, действующие соответственно на β- и α-рецепторы аденилатциклазного комплекса (11). В связи с тем, что изопротеренол в лимфоцитах лабораторных животных активирует аденилатциклазу, в тромбоцитах — ингибирует ее, а простагландин Е1 в обоих случаях стимулирует фермент, последний был выбран нами в качестве эффектора цАМФ-зависимой гормональной регуляции.
В присутствии 10^-5 М простагландина Е1 базальная активность аденилатциклазы в лимфоцитах необлученного КРС возрастала на 70-110, в тромбоцитах — на 100-400 %. Стимулированная компонента активности аденилатциклазы, которая определяется функционированием гормон-связывающей субъединицы фермента, в лимфоцитах и тромбоцитах составляла соответственно 1,08±0,18 пмоль/мин x 10⁶ клеток и 25,4±5,1 пмоль/мин x 10⁸ клеток. На 1-е сут после облучения в лимфоцитах эта компонента увеличилась в 3,19, на 3-и — в 3,54, на 5-е — в 6,56, на 10-е — в 2,97, на 30-е — в 2,58 раза по сравнению с контролем (см. табл.). В тромбоцитах регистрировали снижение стимулированной простагландином Е1 компоненты активности аденилатциклазы на 1-е сут в 1,82, на 3-и — в 4,75, на 5-е — в 1,74, на 7-е — в 4,89, на 10-е — в 10,91, на 15-е — в 4,89 раза.

Коэффициенты стимуляции аденилатциклазы в лимфоцитах практически не различались у контрольных и облученных животных (см. табл.). В тромбоцитах при облучении КРС наблюдалось снижение этого показателя в 1-е сут в 2,04, на 3-и — в 5,06, на 5-е сут — в 1,44, на 7-е — в 1,78, на 10-е — в 3,14 раза.
На 15-30-е сут значения изученных показателей были недостоверны, поскольку большинство животных к этому сроку погибло.
Гормон-стимулированная компонента активности аденилатциклазы и коэффициент стимуляции этого фермента характеризуют эффективность передачи гормонального сигнала в клетки (6). Поэтому можно полагать, что после внешнего воздействия γ-излучения на организм КРС эффективность передачи гормонального стимула в лимфоцитах оставалась такой же, как у необлученных животных, или (с учетом повышения гормон-стимулирован-ной компоненты активности аденилатциклазы) становилась выше, чем в контроле. В тромбоцитах облученных животных эффективность передачи гормонального сигнала заметно снижалась, о чем свидетельствовало угнетение стимулированной простагландином Е1 компоненты активности аденилатциклазы и уменьшение значений коэффициента стимуляции фермента.
Таким образом, в обоих исследованных типах клеток мы выявили изменение базальной и гормон-стимулированной компонент активности аденилатциклазы, в тромбоцитах — уменьшение коэффициента стимуляции, то есть процессы, происходящие в ферментном комплексе, затронули обе субъединицы фермента (и каталитическую, и регуляторную). Функциональная активность фермента в первую очередь зависит от конформации макромолекулы и ее окружения в составе цитоплазматической мембраны (6). Биологические мембраны, в свою очередь, рассматриваются в качестве одной из мишеней действия ионизирующей радиации (12). Поэтому изменения активности аденилатциклазы после лучевого поражения могут быть вызваны радиационно индуцированным нарушением структурно-функ-ционального состояния плазматических мембран у исследованных клеток. 
В то же время при возникновении пострадиационных мембранных нарушений можно ожидать изменения коэффициента стимуляции аденилатциклазы как у тромбоцитов, так и у лимфоцитов. В наших опытах это было выявлено только у тромбоцитов. Возможно, существуют и другие причины модификации активности аденилатциклазы в изучаемых клетках. Известно, что внешнее γ-излучение влияет на субпопуляционный состав лимфоцитов в периферической крови животных: происходит массированная гибель наиболее радиочувствительных и увеличение относительного содержания радиорезистентных клеток этой популяции (13, 14). Наиболее чувствительны к радиационному воздействию В-лимфоциты, которые составляют небольшую часть всех лимфоцитов в периферической крови животных (около 20 % у лабораторных животных, 15-33 % — у КРС) (15, 16). Срок жизни этой субпопуляции клеток в норме 1-5 сут. Через 3 сут после g-облучения животных в периферической крови остается весьма небольшое число этих клеток (16, 17).
Т-лимфоциты — более радиорезистентные и более долгоживущие клетки, срок их жизни составляет 200-300 сут (16). То есть популяция лимфоцитов, циркулирующая в кровеносном русле после облучения животных, представлена в основном Т-лимфоцитами. Можно предположить, что повышенная функциональная активность аденилатциклазы в лимфоцитах связана не только с пострадиационной модификацией цитоплазматической мембраны, но в большей степени представляет собой характерную особенность клеток, остающихся в кровеносном русле после гибели наиболее чувствительной лимфоидной субпопуляции, а также молодых лимфоцитов, вновь выходящих в кровь из пула костного мозга. Лимфоциты облученных животных, циркулирующие в периферической крови, обладают более высокой радиорезистентностью и аденилатциклазной активностью. Тромбоциты еще более радиорезистентны, чем Т-лимфоциты. Срок их жизни в кровеносном русле составляет в норме 5-10 сут (18). К 7-10-м сут тромбоцитарная популяция в периферической крови значительно обновляется. Если эффект g-излучения на активность аденилатциклазы в тромбоцитах в начальный период лучевого поражения реализуется в основном через нарушения в цитоплазматической мембране, то изменение активности фермента на 7-10-е сут, по-видимому, связано с выходом из пула костного мозга в кровь новых клеток с качественно иными свойствами. У обновленной популяции тромбоцитов активность аденилатциклазы (базальная и стимулированная простагландином Е1) и коэффициент стимуляции фермента значительно снижены, а значит, передача гормонального сигнала в клетки менее эффективна.
Итак, при действии внешнего g-излучения в клетках периферической крови крупного рогатого скота изменялась активность ключевого фермента системы цАМФ — аденилатциклазы. В лимфоцитах с 1-х по 30-е сут происходило увеличение базальной и стимулированной простагландином Е1 компонент активности фермента. В тромбоцитах регистрировали угнетение обеих компонент активности аденилатциклазы с 1-х по 15-е сут. Коэффициент стимуляции аденилатциклазы снижался у тромбоцитов и оставался неизменным у лимфоцитов. Можно предположить, что индуцированное облучением организма изменение активности аденилатциклазы в исследованных клетках обусловлено двумя факторами: нарушением структурно-функционального состояния цитоплазматической мембраны и модификацией субпопуляционного состава клеток, циркулирующих в периферической крови. В начальный период радиационного поражения (с 1-х сут) активность фермента изменяется в результате воздействия на мембраны клеток, находящихся в периферической крови. В последующие сроки этот показатель определяется преобладанием в периферической крови более устойчивой к лучевому повреждению субпопуляции лимфоцитов с повышенной активностью аденилатциклазы и обновленной популяции тромбоцитов с пониженной активностью этого фермента системы циклического аденозинмонофосфата.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Т к а ч у к  В.А. Введение в молекулярную эндокринологию. М., 1983.
2. R a s m u s s e n  H.,  G o o d m a n  D.B.P. Relationship between calсium and cyclic nucleotides in cell activation. Physiol. Rev., 1977, 57: 421-509.
3. Л ы с о в  В.Ф.,  Г у д и н  В.А.,  Г у д и н  С.В. Принцип функциональной взаимосвязи и взаимозависимости серотонин-, гистамин- и адренергической систем у животных в онтогенезе. С.-х. биол., 2006, 6: 3-14.
4. Г о н ч а р е н к о  Е.И.,  К у д р я ш о в  Ю.Б. Химическая защита от лучевого поражения. М., 1980.
5. С о б о л е в  А.С. Пострадиационные изменения в системе циклического АМФ органов и тканей, различающихся по радиопоражаемости. В сб.: Проблемы природной и модифицированной радиочувствительности. М., 1983: 205-212.
6. С о б о л е в  А.С. Радиационная химия циклических нуклеотидов. М., 1987.
7. Ш е в ч е н к о  А.С.,  Ш е в ч е н к о  Т.С. Активность аденилатциклазы в тромбоцитах овец. Тез. докл. II Всес. конф. по сельскохозяйственной радиологии. Обнинск, 1984: 106.
8. Ш е в ч е н к о  А.С. Определение активности ферментов метаболизма циклического аденозинмонофосфата в клетках крови овец и лошадей. С.-х. биол., 1988, 6: 124-125.
9. Ш е в ч е н к о  А.С. Изменение активности аденилатциклазы в лимфоцитах и тромбоцитах облученных овец. Радиобиология, 1990, 30(3): 308-311.
10. Ш е в ч е н к о  Т.С. Выделение клеточных популяций из периферической крови сельскохозяйственных животных. С.-х. биол., 2007, 6: 123-126.
11. Ч и р к о в  Ю.Ю.,  Б а б и н  Н.Н.,  С о б о л е в  А.С. Бета-адренергический механизм противолучевого действия изопротеренола на культуру клеток млекопитающих. Радиобиология, 1983, 23(6): 819-822.
12. Ф о м е н к о  Б.С.,  А к о е в  И.Г. Структурные изменения плазматической мембраны под действием ионизирующей радиации. Усп. совр. биол., 1982, 93(2): 183-195.
13. Б о н д  В.,  Ф л и д н е р  Т.,  А р ш а м б о  Д. Радиационная гибель млекопитающих. Нарушение кинетики клеточных популяций. М., 1974.
14. Х а н с о н  К.И.,  К о м а р  В.Е. Молекулярные механизмы радиационной гибели клеток. М., 1985.
15. Р а д ч е н к о в  В.П.,  Х л о п о н и н  В.С. Т-лимфоциты крупного рогатого скота. Функции и маркерные молекулы. С.-х. биол., 2005, 2: 23-31.
16. Я р и л и н  А.А. Действие ионизирующей радиации на лимфоциты (повреждающий и активизирующий эффекты). Иммунология, 1988, 5: 5-11.
17. Б у д а р к о в  В.А.,  Л а з а р е в  Н.М. О видовой радиочувствительности Т- и В-лимфоцитов. Радиобиология, 1990, 30(4): 532.
18. E b b l e  S. Origin production and life-span of blood platelets. In:  The Circulating Platelet /S.A. Jonson (ed.). N.Y.-London, Academic Press, 1971: 19-39.

ADENYLATE CYCLASE ACTIVITY IN LYMPHOCYTES AND THROMBOCYTES OF CATTLE AFTER RADIOACTIVE IRRADIATION

T.S. Shevchenko, I.V. Konopleva

The authors investigated the adenylate cyclase activity in the lymphocytes and thrombocytes of cattle exposed to total external γ-radiation at a dose of 3.5 Gy. After radiation action the basal and prostaglandin E1 stimulated components of adenylate cyclase activity in lymphocytes were manyfold increased, but these components in thrombocytes were significantly reduced. Reduction was reported in the adenylate cyclase stimulation

Keywords: cattle, external γ-irradiation, lymphocytes, thrombocytes, camp system ade-nylatе cyclase, coefficient of adenylate cyclase stimulation.

Оформление электронного оттиска