БИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
БИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ
ПЕЧАТНАЯ ВЕРСИЯ
ЭЛЕКТРОННАЯ ВЕРСИЯ
 
КАРТА САЙТА
НА ГЛАВНУЮ

УДК 636/639:614.31

МЕТОДЫ САНИТАРНОГО КОНТРОЛЯ ЖИВОТНОВОДЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ. СООБЩЕНИЕ III. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНТАМИЦИНА

М.А. БУРКИН1, Г.П. КОНОНЕНКО2, А.А. БУРКИН2

Показано, что поликлональные кроличьи антитела, полученные к двум разным по строению конъюгированным антигенам гентамицина с бычьим сывороточным альбумином, обладают одинаково высокой специфичностью. В оптимизированных условиях непрямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) чувствительность определения антибиотика составляет 1 и 10 нг/мл. Обсуждается возможность применения разработанных иммуноферментных тест-систем для контроля за остатками гентамицина в молочной и мясной продукции.

Ключевые слова: гентамицин, молоко, мясо, иммуноанализ.

 

Гентамицин (ГМ, антибиотик группы аминогликозидов) широко применяется в отечественном и мировом животноводстве в составе препаратов для инъекций или выпаивания животным (1, 2). В настоящее время зарубежными исследователями предложено несколько вариантов иммуноанализа (3-5) для контроля загрязненности молока и мяса этим антибиотиком.
Наша цель заключалась в получении специфических иммунореагентов на основе гентамицина и оптимизации условий его определения в животноводческой продукции методом непрямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Методика. В работе использовали гентамицинсульфат (G 632), α1-кислый гликопротеин (ГП) из бычьей плазмы (G 3643) («Sigma», США), глутаровый альдегид («Reanal», Венгрия), органические растворители («Flu-ka», Германия), бычий сывороточный альбумин (БСА), кроличий сывороточный альбумин (КСА), желатин (Жел), янтарный ангидрид, периодат натрия, боргидрид натрия и антивидовой ферментный конъюгат, полученный, как описано (6), из пероксидазы хрена (КФ 1.11.1.7) и антисыворотки осла к иммуноглобулинам кролика (Россия). ИФА выполняли на высокосвязывающих полистирольных планшетах («Costar», США) с использованием фотометра АКИ-Ц-01 (Россия). УФ-спектры записывали на приборе Hitachi-557 («Hitachi», Япония).
Синтез конъюгатов ГМ с нативными БСА и Жел осуществляли при помощи глутарового альдегида, предварительно сукцинилированных белков (сБСА, сКСА и сЖел) — методом карбодиимидной конденсации. Конъюгирование с ГП выполняли в условиях периодатного окисления (7).
Для получения БСА-ГМ(100), Жел-ГМ(5), Жел-ГМ(10) и Жел-ГМ(25) к раствору БСА (5 мг в 2,0 мл воды) добавляли ГМ (6 мг), а к трем порциям раствора Жел (по 8 мг, или 0,05 мкмоль, в 1,5 мл воды) — аликвоты раствора ГМ (4 мг в 0,4 мл воды), необходимые для соответствующих мольных избытков. Далее в реакционные смеси вносили по 30 мкл свежеприготовленного 2,5 % глутарового альдегида, перемешивали на магнитной мешалке в течение 2 ч при комнатной температуре, приливали по 100 мкл раствора боргидрида натрия (2 мг/мл), продолжали перемешивание в течение еще 1 ч при 4 °С, после чего диализовали против трех смен 1000-кратного объема 0,5 % раствора хлористого натрия. При получении сБСА-ГМ(50), сКСА-ГМ(50) и сЖел-ГМ(50) к растворам БСА, КСА или Жел (соответственно 7,0; 6,5 и 8,0 мг, или 0,1; 0,1 и 0,05 мкмоль,) в воде (0,5 мл) добавляли каплю 1 н. NaOН и 5 мг янтарного ангидрида (20 мкмоль) в диметилформамиде (0,5 мл). Реакционные смеси помещали на магнитную мешалку на 2 ч при комнатной температуре, поддерживая рН 9,0-9,5, после чего диализовали против 1000-кратного объема 0,15 М фосфатного буфера (рН 5,5). К раствору каждого из сукцинилированных белков приливали водорастворимый карбодиимид (9,5 мг, или ~ 50 мкмоль), а через 30 мин — 50-кратный мольный избыток ГМ (соответственно 2,50; 2,50 и 1,25 мг), перемешивали в течение 14 ч при комнатной температуре и подвергали диализу против трех смен 1000-кратного объема 0,5 % раствора хлористого натрия. Для синтеза ГП-ГМ(50) к раствору ГП (4 мг, или 0,1 мкмоль, в 1 мл воды) добавляли NaIO4 (4 мг) с последующим перемешиванием на магнитной мешалке (30 мин) и диализом против 0,001 М уксусной кислоты (16 ч). По завершении диализа к окисленному белку приливали раствор ГМ (2,5 мг в 0,5 мл 0,05 М карбонатного буфера, рН 9,5), помещали на мешалку на 2 ч, затем вносили в смесь 200 мкл NaBН4 (2 мг/мл), выдерживали при периодическом помешивании 2 ч при 4 °С и диализовали против трех смен 1000-кратного объема 0,5 % раствора хлористого натрия. К конечным продуктам всех реакций после диализа против раствора хлористого натрия приливали равный объем глицерина и хранили при температуре -10…-15 °С.
Кроликов-самцов серой масти (живая масса 2-3 кг) иммунизировали конъюгатами сБСА-ГМ(50) и БСА-ГМ(100). Подкожно (в 10-15 точек в области спины) животные в первую инъекцию получали 100 мкг иммуногена в полном адъюванте Фрейнда, далее (с месячными интервалами) во вторую и все последующие — по 100 мкг иммуногена в физиологическом растворе. Через 7 сут после инъекций, начиная со второй, у животных из краевой вены уха отбирали кровь, отделяли сыворотку, добавляли равный объем глицерина и хранили при -10…-15 °С.
Тестирование сывороток, оценка специфичности антител, испытание конъюгатов в качестве твердофазных антигенов и проведение ИФА не отличались от описанных ранее (8). Для анализа использовали пробы мяса и молока из торговой сети г. Москвы.
Результаты. Для конъюгирования ГМ, имеющего в молекуле первичные аминогруппы, применили альтернативные способы: через аминогруппы белков — в реакции с глутаровым альдегидом, через карбоксильные группы — при карбодиимидной конденсации, а также прямое связывание с альдегидными группами предварительно окисленного гликопротеина (ГП). Опыт успешного использования таких приемов в синтезе конъюгатов других физиологически активных веществ описан нами ранее (9, 10).
Факты связывания ГМ с белками можно было подтвердить только иммунохимически, так как максимумы поглощения этого вещества (11), которые находятся около l = 250 нм, в конъюгатах перекрываются широким пиком поглощения у белкового носителя с центром при l = 280 нм. Уточнение концентраций аналитических растворов ГМ спектрометрическим методом также оказалось невозможным, поскольку для водных и водно-ацетонитрильных растворов с концентрациями до 200 мкг/мл эффект абсорбции нам обнаружить не удалось, по-видимому, из-за крайне слабой интенсивности.
Первый выбранный для иммунизации конъюгат сБСА-ГМ(50) уже после третьего введения животным (при 2-м отборе крови) обеспечил получение антител с рабочим титром 1:17 000 и возможность определения ГМ в растворах до концентрации 10 нг/мл. Продолжение процедуры иммунизации до 4-го получения сыворотки крови сопровождалось сохранением высокого рабочего титра антител и увеличением чувствительности теста


Рис. 1. Степень связывания антител к сБСА-ГМ(50), полученных при 1-4-м отборах крови (1-4), с иммобилизованным антигеном сЖел-ГМ(50) (А) и антител к БСА-ГМ(100), полученных при 1-3-м отборах крови (5-7), с иммобилизованным антигеном Жел-ГМ(25) (Б) в присутствии гентамицина при непрямом конкурентном твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА): БСА и сБСА, Жел и сЖел, ГМ — соответственно обычный и сукцинилированный бычий сывороточный альбумин, обычный и сукцинилированный желатин, гентамицин.

на порядок (рис. 1, А). Линейность аналитического сигнала в интервале 10-90 % связывания антител для концентраций 1-100 нг/мл обеспечивал только иммобилизованный конъюгат ГП-ГМ, полученный методом гетерологичного синтеза, остальные уступали ему, но также были иммунореактивными (табл. 1).

1. Степень связывания (%) антител к сБСА-ГМ(50) при непрямом конкурентном твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) в присутствии ГМ с использованием антисыворотки от 4-го отбора крови и различных иммобилизованных антигенов

Иммобилизованный
антиген (С = 0,15 мкг/мл)

ГМ, нг/мл

1000

100

10

1

ГП-ГМ(50)

0

13

38

77

сБСА-ГМ(50)

22

41

63

86

сКСА-ГМ(50)

23

42

65

90

сЖел-ГМ(50)

14

26

46

73

Жел-ГМ(5)

Не определяли

43

80

102

Жел-ГМ(10)

Не определяли

41

79

104

Жел-ГМ(25)

Не определяли

49

80

99

П р и м е ч а н и е. ГМ, ГП, Жел, сБСА, сКСА и сЖел — соответственно гентамицин, гликопротеин, желатин, сукцинилированные бычий сывороточный альбумин, кроличий сывороточный альбумин и желатин.

2. Степень связывания (%) антител к БСА-ГМ(100) при непрямом конкурентном твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) в присутствии ГМ с использованием антисыворотки от 1-го отбора крови и различных иммобилизованных антигенов

Иммобилизованный антиген
(С = 0,15 мкг/мл)

ГМ, нг/мл

100

10

1

ГП-ГМ(50)

22

50

90

сКСА-ГМ(50)

40

73

96

сЖел-ГМ(50)

41

74

98

Жел-ГМ(5)

24

60

90

Жел-ГМ(10)

21

55

91

Жел-ГМ(25)

24

60

93

П р и м е ч а н и е. То же, что в таблице 1.

Начало иммунного ответа на конъюгат БСА-ГМ(100) было более активным (см. рис. 1, Б). Уже с сывороткой от 1-го отбора крови наблюдалось отчетливое торможение связывания как с гомологичными, так и с гетерологичными твердофазными антигенами при концентрации раствора ГМ 10 нг/мл (табл. 2).  
При 2-м отборе произошло некоторое возрастание чувствительности анализа, а использование антисыворотки от 3-го отбора позволило не только снизить концентрацию антигенов, используемых в качестве твердой фазы при ИФА, но и повысить чувствительность почти на порядок (см. рис. 1, Б). Со всеми гомологичными твердофазными антигенами — Жел-ГМ(5), Жел-ГМ(10), Жел-ГМ(25) при их использовании в концентрации 0,05 мкг/мл явное торможение связывания антител достигалось уже для раствора ГМ с концентрацией 0,1 нг/мл (табл. 3), а зависимость между долей связывания антител и количеством ГМ в растворе имела характер, близкий к линейному.

3. Степень связывания (%) антител к БСА-ГМ(100) при непрямом конкурентном твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) в присутствии ГМ с использованием антисыворотки от 3-го отбора крови и различных иммобилизованных антигенов

Иммобилизованный
антиген (С = 0,05 мкг/мл)

ГМ, нг/мл

10

1

0,1

ГП-ГМ(50)

29

48

69

Жел-ГМ(5)

16

34

76

Жел-ГМ(10)

17

31

71

Жел-ГМ(25)

17

32

73

П р и м е ч а н и е. То же, что в таблице 1.

Распознавания антителами других аминогликозидов, в частности канамицина, стрептомицина, амикацина, тобрамицина и мономицина, которые применяются в качестве ветеринарных препаратов наряду с ГМ, не регистрировали до их концентраций 10 000 нг/мл. Это свидетельствовало о высокой специфичности анализа и возможности применения обоих вариантов ИФА для избирательной индикации ГМ в пробах. Интересно отметить, что в ИФА с антителами к БСА-ГМ и иммобилизованным конъюгатом ГМ с овальбумином перекрестная реактивность с другими аминогликозидными антибиотиками (канамицином, стрептомицином и неомицином) была ниже 1 % (12). Ранее для индукции высокоспецифичных антител к ГМ M.B. Lui и соавт. (13) рекомендовали специальную процедуру, при которой кролику сначала вводят конъюгат с БСА в полном адъюванте Фрейнда в подушечки лап, а затем многократно — конъюгаты ГМ с эритроцитами внутривенно, но в этом, как показывают наши результаты, нет необходимости. Более того, подобная процедура иммунизации весьма травматична и, как правило, тяжело переносится животными.
Таким образом, оба конъюгата ГМ, синтезированные для целей иммунизации, при обычной процедуре ее выполнения индуцировали выработку высокоспецифичных антител. За рубежом для контроля остатков ГМ в животноводческой продукции выпускаются диагностические наборы в разных форматах — от быстрых оценочных тестов, в частности ELISA-card (EZ-Screen: Gentamicin, «Environmental Diagnostics, Inc.», США), ELISA-tube test (LacTek Milk Gentamicin Screening Kit, «Idetek, Inc.», США), ELISA-probe (Cite Probe Gentamicin Milk Test, «IDEXX Corporation», США), до традиционного анализа, например ELISA-wells (Signal Gentamicin Detection Test, «Smith-Kline Animal Health Products», США; AGRI-SCREEN, «Neogen Corporation», США; Assay kits, «Techna», Италия). Полученные реагенты могут быть использованы для создания подобных тест-систем и в нашей стране.
Непрямой конкурентный анализ на основе обоих типов антител функционировал стабильно при обычных колебаниях внешних факторов. Судя по градуировочным графикам, полученным в условиях промежуточной прецизионности ежедневно или с интервалом 1-2 сут, аналитические показатели (n = 10) имели относительное стандартное отклонение не более 0,05.
При выполнении анализа с растворами ГМ в 0,15 М фосфатно-со-левом буфере (рН 7,5), содержащем Na2HPO4 (0,01 М), NaCl (0,14 M) и Твин 20 (0,05 %) (ФСБ-т), а также в молоке, разбавленном этим буфером в 3 раза, калибровочные графики практически не различались (рис. 2).  Анализ 19 проб пастеризованного и стерилизованного молока с помощью тест-системы на основе антител к БСА-ГМ(100) (диапазон измерения ГМ — от 1 до 100 нг/мл) показал, что пять из них имеют загрязненность ГМ от 11 до 67 мкг/кг. Из семи образцов сухого молока ГМ-положи-тельным оказался один (содержание антибиотика — 30 мкг/кг, или 3 мкг/кг для восстановленного молока). В производственных условиях для контроля молока могут быть рекомендованы обе тест-системы, поскольку чувствительность определения 3 и 30 мкг/кг позволяет надежно измерять ПДК 200 мкг/кг, или 0,2 мг/кг продукта (14), и в течение 3,5-4,0 ч можно исследовать несколько десятков образцов.


Рис. 3. Калибровочные графики при непрямом конкурентном твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) гентамицина с использованием антисыворотки к БСА-ГМ(100) от 3-го отбора крови и иммобилизованного антигена Жел-ГМ(25), полученные для буфера ФСБ-т (1), смеси ацетонитрила с водой при 10-кратном разбавлении ФСБ-т (2), водно-ацетонитрильного экстракта мышечной ткани кур при 10-кратном разбавлении ФСБ-т (3) и молока при 3-кратном разбавлении ФСБ-т (4): БСА, Жел, ГМ, ФСБ-т — соответственно бычий сывороточный альбумин, желатин, гентамицин, фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий Твин 20.

S.A. Brown с соавт. (15) для извлечения ГМ из тканей животных предлагали гомогенизацию в буферных растворах или замачивание в едком натре на 20 мин при 70 °С. По нашим данным, ГМ можно определять в экстрактах животных тканей, приготовленных с добавлением к навеске предварительно высушенного гомогената равного количества (масса/объем) смеси ацетонитрила с водой в соотношении 84:16. При анализе на основе антител к БСА-ГМ(100) с использованием водного ацетонитрила и водно-ацето-нитрильного экстракта мышечной ткани кур после 10-кратного разбавления ФСБ-т калибровочные графики прак-тически не отличались от полученных для ФСБ-т и молока, разбавленного ФСБ-т (диапазон измерения ГМ — от 1 до 100 нг/мл) (см. рис. 2). В этих условиях нижние пределы обнаружения ГМ в мясе с помощью двух предложенных нами тест-систем составляют 10 и 100 мкг/кг. Действующие в нашей стране нормативы по допустимым количествам остатков ГМ в мясе и печени крупного рогатого скота, овец, свиней и птицы (0,1 мг/кг), а также в почках (2,0 мг/кг) (14) на 1-3 порядка превышают чувствительность предложенных вариантов ИФА. Как правило, ГМ не вносят в корма, но при необходимости для их анализа также можно выполнять экстракцию с помощью водного ацетонитрила и обеспечить нижний предел определения 5 мкг/кг.
Итак, разработанные варианты непрямого конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) способны обеспечивать избирательное и высокочувствительное определение гентамицина и могут быть использованы для контроля остатков этого антибиотика в животноводческой продукции.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. К л е н о в а  И.Ф.,  Я р е м е н к о  Н.А. Ветеринарные препараты в России: Справочник. М., 2001.
2. Справочник ветеринарных препаратов /Под ред. Е.А. Панковца. Минск, 1996.
3. P h a n e u f  D.,  F r a n c k e  E.,  N e u  H.C. Rapid, reproducible enzyme immunoassay for gentamicin. J. Clin. Microbiol., 1980, 11(3): 266-269.
4. A r a  J.,  G a n s  Z.,  S w e e n e y  R.,  W o l f  B. Dot-ELISA for the rapid detection of gentamicin in milk. J. Clin. Lab. Anal., 1995, 9(5): 320-324.
5. H a a s n o o t  W.,  V e r h e i j e n  R. A direct (non-competitive) immunoassay for gentamicin residues with an optical biosensor. Food Agricult. Immunol., 2001, 13(2); 131-134.
6. N a k a n e  P.K.,  K a w a o i  A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem., 1974, 22(2): 1084-1091.
7. H e r m a n s o n  G.T. Bioconjugate techniques. San Diego—N.Y.—Boston—London—Syd-ney—Tokyo—Toronto, 1996.
8. Б у р к и н  А.А.,  К о н о н е н к о  Г.П.,  Б у р к и н  М.А. Методы санитарного контроля животноводческой продукции. Сообщение I. Иммуноферментный анализ тетрациклинов. С.-х. биол., 2010, 4: 110-117.
9. Б у р к и н  А.А.,  Б у р к и н  М.А. Получение антител к 1,4-дигидропиридиновым блокаторам кальциевых каналов. Прикладная биохимия и микробиология, 2008, 44(3): 357-361.
10. Б у р к и н  А.А.,  Б у р к и н  М.А. Иммуноферментный анализ клофелина. Судебно-медицинская экспертиза, 2007, 4: 30-32.
11. C l a r k  E.G.C. Isolation and identification of drugs. London, The Pharmaceutical Press, 1986.
12. К о л о с о в а  А.Ю.,  Б л и н ц о в  А.Н.,  С а м с о н о в а  Ж.В.,  Е г о р о в  А.М. Разработка твердофазного иммуноферментного анализа гентамицина в сыворотке крови человека. Антибиотики и химиотерапия, 1998, 2: 9-13. 
13. L u i  M.B.,  B l a c k s t o c k  R.,  H y d e  R.M. A rapid method to produce anti-genamicin antibody. J. Antibiot. (Tokyo), 1981, 34(7): 898-901.
14. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. СанПиН 2.3.2.1078-01. М., 2002.
15. B r o w n  S.A.,  N e w k o r k  D.R.,  H u n t e r  R.P.,  S m i t h  G.G.,  S u g i m o t o  K. Extraction methods for quantitation of gentamicin residues from tissues using fluorescence polarization immunoassay. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1990, 73(3): 479-483.

 

METHODS OF SANITARY SURVEILLANCE OF LIVESTOCK PRODUCTION. III. ENZYMOIMMUNOASSAY OF GENTAMYCIN

M.A. Burkin1, G.P. Kononenko2, A.A. Burkin2

During optimization of the conditions of indirect competitive solid-phase enzymoimmunoassay the authors revealed that two species of polyclonal rabbit antibodies, obtained to previously synthesized conjugate antigens with different structure on basis of gentamycin, have equal high specificity, and sensitivity of determination is 1-10 ng/ml of gentamycin. The possibility of the use such test-system for the control of gentamycin contamination in milk and meat production is discussed.

Keywords: gentamicin, milk, meat, immunoassay.

1НИИ вакцин и сывороток
им. И.И. Мечникова РАМН,

105064 г. Москва, Малый Казенный пер., 5а,
e-mail: instmech@iitp.ru;
2ГНУ Всероссийский НИИ ветеринарной
санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии,

123022 г. Москва, Звенигородское ш., 5,
e-mail: vniivshe@mail.ru

Поступила в редакцию
8 ноября 2010 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало

От эксперимента —
к практике



Всероссийский НИИ
селекции и семеноводсва
овощных культур



Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства


Всероссийский НИИ cельскохозяйственной биотехнологии РАСХН


Биотехнический научно-экспериментальный комплекс "ГосНИИсинтезбелок"