doi: 10.15389/agrobiology.2020.1.77rus
УДК 635.21:632.3.01/.08:577.2.08
Статья подготовлена в рамках ФНТП развития сельского хозяйства РФ на 2017-2025 годы (подпрограмма «Развитие селекции и семеноводства картофеля в Российской Федерации»).
РАЗРАБОТКА НОВЫХ СИСТЕМ ПЦР-ИДЕНТИФИКАЦИИ
НЕКАРАНТИННЫХ ПАТОГЕНОВ КАРТОФЕЛЯ (Solanum tuberosum L.), РАСПРОСТРАНЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ
А.А. СТАХЕЕВ1, М.С. ЧИГАРЁВА1, А.И. УСКОВ2, И.В. ШМЫГЛЯ2,
Ю.А. ВАРИЦЕВ2, П.А. ГАЛУШКА2, С.К. ЗАВРИЕВ1
Российская Федерация — один из крупнейших производителей картофеля в мире: за 2018 год посевные площади этой культуры на территории страны составили 310,7 тыс. га, а валовые сборы в промышленном секторе — 7157 тыс. т. Однако для современного картофелеводства характерно прогрессивное распространение вирусных болезней и бактериозов, приводящих к снижению урожая и катастрофическому ухудшению стандартного качества клубней. В настоящее время в картофелеводстве широко применяются классические методы диагностики, в частности растения-индикаторы, серологические и цитологические подходы. Они относительно надежны, но не всегда достаточно чувствительны, требуют высокой квалификации персонала и существенных затрат времени. Современной альтернативой этим методам служат диагностические системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), в частности ее модификации в формате реального времени (количественная ПЦР). В представленном исследовании для шести некарантинных патогенов (некротических штаммов Y вируса картофеля PVYN-NTN и PVYN:O, вируса погремковости табака, патогенных бактерий Dickeya solani, D. dianthicola, Pectobacterium atrosepticum) впервые в России были разработаны системы диагностики и идентификации в формате количественной ПЦР. Праймеры и флуоресцентно меченные зонды подбирали на основе последовательностей нуклеотидов, представленных в международной базе данных NCBI GenBank, с учетом размера ампликона не более 500 п.н. Специфичность предложенных систем была показана в тестах с генетическим материалом патогенов, таксономически близких или занимающих сходные экологические ниши: ординарный штамм PVY, вирус метельчатости верхушки картофеля, бактерии Pectobacterium carotovorum, D. zeae.Качество работы предложенных тест-систем также оценивали с использованием растительного материала, предположительно зараженного анализируемыми патогенами. Выделение нуклеиновых кислот осуществляли с использованием комплектов реактивов Проба-НК (для РНК) и Проба-ГС (для ДНК) (ООО «АгроДиагностика», Россия). Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор RevertAidPremium First Strand cDNA Synthesis Kit («Thermo Scientific», США). ПЦР проводили в амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия), количественную ПЦР — в детектирующем амплификаторе ДТ-96 («ДНК-технология», Россия). Для оценки возможного ингибирования в реакционную смесь добавляли внутренний контрольный образец (ВКО), представляющий собой плазмиду со специфической вставкой (размер 560 п.н.). Положительные контрольные образцы (ПКО) клонировали с использованием набора Quick-TA kit («Евроген», Россия). Концентрацию плазмидной ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanoVue («GE HealthCare», США). Секвенирование молекул ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3730 («Applied Biosystems», США). Аналитическую чувствительность оценивали с использованием количественной ПЦР, при которой в качестве матрицы выступали последовательные 10-кратные разведения плазмидных ДНК (ПКО в четырех независимых повторностях) в диапазоне от 107 до 100 копий на реакцию. Была показана высокая чувствительность разработанных тест-систем, составившая от 10 до 500 копий специфической ДНК на реакцию, а также высокая воспроизводимость (Cv 1,5-2,0 %). Максимальное разгорание разработанных гидролизуемых зондов составило от 1200 до 2000 ед. фона. Универсальность предложенных профилей амплификации может послужить основой для адаптации тест-систем в формат мультиплексной ПЦР. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что разработанные системы с высокой специфичностью и чувствительностью детектируют анализируемые патогены и могут быть использованы в рамках мероприятий по фитосанитарному контролю и рутинной диагностике шести некарантинных патогенов в растениях, посадочном материале и пищевой продукции.
Ключевые слова: диагностика, количественная ПЦР, чувствительность, специфичность, Pectobacterium atrosepticum, Dickeya solani, Dickeyadianthicola, некротические штаммы Y вируса картофеля, PVY, вирус погремковости табака.
A.A. Stakheev1, M.S. Chigareva1, A.I. Uskov2, I.V. Shmyglya2,
Yu.A. Varitsev2, P.A. Galushka2, S.K. Zavriev1
Russia is among the largest potato producers in the world. According to statistics for 2018, the sown area of potatoes amounted to 310.7 thousand ha, which is 3.5 % more than in 2017, and the gross harvest in the industrial sector is 7157 thousand tons. At the same time, potatoes are susceptible to infection by various plant pathogens of different taxonomic groups. In modern potato growing, the progressive spread of viral and bacterial diseases, which, in addition to reducing the yield, causes a catastrophic deterioration of tubers’ quality, leads to a serious problem for commercial production. Not all dangerous pathogens belong to quarantine organisms in Russia. However, the need for their accurate and highly specific identification is not less than for quarantine organisms. Currently, classic diagnostic methods in potato growing are indicator plants, serological and cytological tests. They are relatively reliable, but not always sensitive enough, time-consuming and their use requires highly qualified personnel. A modern alternative to these methods are diagnostic systems based on polymerase chain reaction (PCR), in particular, its real-time modification (quantitative PCR, qPCR). In the present study, for the first time in Russia, qPCR-based tests were developed for six non-quarantine pathogens — necrotic strains of potato virus Y (PVYN-NTN and PVYN:O), tobacco rattle virus (TRV), and pathogenic bacteria Dickeya solani, D. dianthicola, and Pectobacterium atrosepticum. Primers and fluorescent-labeled probes were designed based on nucleotide sequences presented in the NCBI GenBank international database for the amplicon size not more than 500 bp. The specificity of the proposed systems was shown in tests with the genetic material of pathogens that infect potatoes, which are taxonomically close or occupy similar ecological niches, such as the ordinary strain PVY, potato mop-top virus, Pectobacterium carotovorum, and D. zeae. The quality of the proposed test systems was also evaluated using plant material, presumably infected with the analyzed pathogens. Nucleic acids were isolated using Proba-NK (for RNA) and Proba-GS (for DNA) reagents (AgroDiagnostica LLC, Russia). For the reverse transcription reaction, the RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, USA) was used. PCR was carried out in the Tertsik amplifier (DNA-technology, Russia), and quantitative PCR was performed in the DT-96 detection amplifier (DNA-technology, Russia). To assess possible inhibition, an internal control sample (IC, a plasmid with a specific 560 bp insert) was added to the reaction mixture. Positive control samples (PCs) were cloned using the Quick-TA kit (Evrogen, Russia). Plasmid DNA concentration was determined (a NanoVue spectrophotometer, GE HealthCare, USA). DNA molecules were sequenced (an ABI PRISM 3730 automated sequencer, Applied Biosystems, USA). Analytical sensitivity was evaluated by quantitative PCR, in which sequential 10-fold dilutions of plasmid DNA (PC in four independent replicates) in the range of 107 to 100 copies per reaction were used as matrices. High sensitivity of the developed test systems, ranging from 10 to 500 copies of specific DNA per reaction, as well as high reproducibility (Cv 1.5-2.0 %) were shown. The maximum fluorescence increase for the developed hydrolyzed probes ranged from 1200 to 2000 units of background. The universality of the proposed amplification profiles can serve as the basis for adapting test systems to the multiplex PCR format. The obtained results indicate that these systems detect the analyzed pathogens with high specificity and sensitivity and can be used as part of phytosanitary control and routine diagnosis of 6 non-quarantine pathogens in plants, planting material and food products.
Keywords: diagnostics, quantitative PCR, sensitivity, specificity, Pectobacterium atroseptic.
1ФГБУН Институт биоорганической химии |
Поступила в редакцию |
