doi: 10.15389/agrobiology.2020.1.87rus
УДК 635.21:632.7:632.937.15
Работы по полногеномному секвенированию проведены при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации. Аннотация токсинов и факторов вирулентности выполнена при поддержке РНФ, грант № 18-76-00028.
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОМА ШТАММА
Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 И ИЗУЧЕНИЕ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ
М.Е. БЕЛОУСОВА1, С.Д. ГРИШЕЧКИНА1, В.П. ЕРМОЛОВА1, К.С. АНТОНЕЦ1, А.В. МАРДАНОВ2, А.Л. РАКИТИН2, А.В. БЕЛЕЦКИЙ2, Н.В. РАВИН2, А.А. НИЖНИКОВ1
Полифункциональные микробиологические препараты перспективны в использовании для защиты растений, поскольку обладают многоплановым действием, включающим ростостимулирующий эффект, комплексную антифунгальную и инсектицидную активность. Один из ключевых микроорганизмов, используемых в качестве основы для создания биологических препаратов, — грамположительная спорообразующая бактерия Bacillus thuringiensis (Bt). Высокая специфичность действия и экологическая безопасность препаратов на основе Bt способствуют поддержанию биоценотического равновесия и позволяют сократить количество обработок, а также получить экологически чистую продукцию. Во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии был выделен и селектирован штамм Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH10 56), в лабораторных условиях проявлявший инсектицидное действие на личиночные стадии листогрызущих насекомых-вредителей, ростостимулирующую активность в отношении картофеля и других сельскохозяйственных культур, а также антифунгальный эффект против ряда фитопатогенных грибов. В настоящей работе впервые проведено секвенирование и аннотация полного генома штамма продуцента ВtH10 56, выявлены факторы, обусловливающие инсектицидную и антифунгальную активность этого штамма, а также показана высокая эффективность биологического препарата на его основе в полевых условиях против колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say. Цель работы — выявление молекулярных детерминант инсектицидных свойств штамма-продуцента Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56, а также испытание его активности в полевых условиях. Полевые испытания эффективности биопрепарата на основе штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH10 56) против колорадского жука проводили на картофеле (Solanum tuberosum L.) сортов Винета и Рокко в 2018 и 2019 годах (ООО «МТС-Агро», Воронежская обл.) на площади 1 га. Для оценки энтомоцидной активности использовали жидкую форму препарата на основе штамма, наработанного в филиале ФГБНУ ВНИИСХМ «Экос» (титр спор 2,12-2.3×109 КОЕ/мл) на дрожже-полисахаридной среде в ферментерах объемом 100 л. Норма применения препарата — 20 л/га. Посадки картофеля обрабатывали с использованием опрыскивателя ОПГ-2000 (ООО «Заря», Россия). В качестве химического эталона использовали инсектицидные препараты Цепеллин, КЭ и Колорадо, ВРК (ООО «Агро Эксперт Груп», Россия) в дозах соответственно 100 г/л и 0,1 л/га. Учеты проводили перед и после обработки (на 5-е, 10-е и 14-е сут). Биологическую эффективность препарата определяли по снижению численности вредителя по формуле Abbott. По результатам испытаний была установлена высокая эффективность разработанного препарата против колорадского жука, которая на 10-е сут составляла 83,8-87,8 % и не отличалась от химического эталона. С использованием технологии Illumina («Illumina, Inc.», США) и мономолекулярного нанопорового секвенирования («Oxford Nanopore», Великобритания) была получена полная последовательность генома штамма-продуцента ВtH10 56. Для поиска и классификации генов инсектицидных токсинов Вt использовали программы CryProcessor и BtToxin_scanner, в результате чего был идентифицирован ген cry1Ea7, относящийся к группе сry1E, для которой описана активность в отношении различных чешуекрылых (Lepidoptera). Исследованный штамм не содержал генов, кодирующих токсины групп Vip, Sip и Cyt, однако нес ряд генов, кодирующих синтетазы нерибосомно синтезируемых пептидов (nrp), что объясняет его полифункциональные свойства. Полученные данные позволяют рекомендовать биологический препарат на основе BtH10 56 для использования в промышленности и органическом земледелии.
Ключевые слова: Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis, инсектицидная активность, экзотоксин, эндотоксин, Oxford Nanopore, Illumina, токсин Cry, Bt, колорадский жук, Leptinotarsa decemlineata.
M.E. Belousova1, S.D. Grishechkina1, V.P. Ermolova1, K.S. Antonets1,A.V. Mardanov2, A.L. Rakitin2, A.V. Beletsky2, N.V. Ravin2,
A.A. Nizhnikov1
Multifunctional microbiological preparations are promising for use in plant protection due to their diverse effects including growth-promoting effect and complex antifungal and insecticidal activity. One of the key microorganisms used as the basis of biological preparations production is the gram-positive spore-forming bacterium Bacillus thuringiensis (Bt). The high specificity of the action and the environmental safety of Bt-based preparations contribute to maintain biocenosis balance and to reduce the number of treatments as well as to obtain environmentally friendly products. Previously, Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 (BtH10 56) strain was isolated and selected at the All-Russian Research Institute of Agricultural Microbiology. It possesses insecticidal effect for the larval stages of leaf-eating insect pests, growth-promoting activity for potatoes and antifungal effect against various phytopathogenic fungi. This paper presents the first data on sequencing and annotation of the whole genome of the BtH10 56 industrial strain; the factors responsible for the insecticidal and antifungal activity of this strain are identified, and the high efficiency of the biological preparation based on this strain is demonstrated under the field conditions against the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say.). The goal of the work was to identify the molecular determinants of the insecticidal properties of the industrial strain Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 as well as to test its activity in the field. Field trials of the effectiveness of the biological preparation based on BtH10 56 against the Colorado potato beetle was carried out on potatoes (Solanum tuberosum L.) of the Vineta and Rocco varieties in 2018 and 2019 (MTS-Agro LLC, Voronezh Province) in the area of 1 ha. To evaluate the entomocidal activity, we used a liquid form of the preparation based on the strain produced by the Ekos branch of ARRIAM (the spore titer was 2.12-2.3×109 CFU/ml) in yeast-polysaccharide medium in a 100 l bioreactor. The application rate of the preparation was 20 l/ha. The potato plantings were treated using an OPG-2000 sprayer (Zarya LLC, Russia). As a chemical standard, the insecticidal preparations Cepellin, EC and Colorado, SC (Agro Expert Group LLC, Russia) at 100 g/l and 0.1 l/ha doses, respectively, were used as the chemical standards. The counts were carried out in 5, 10 and 14 days after treatment. The biological effectiveness of the preparation was determined by analyzing a decrease in the number of pests according to the Abbott formula. According to the test results, the high efficiency of the developed preparation against the Colorado potato beetle was established. This efficiency varied from 83.8 to 87.8 % and did not differ from the chemical standards. Using Illumina and Oxford Nanopore technology, we obtained the whole genome sequence of the ВtH10 56 strain. After assembly and annotation of the genome, a search for toxins was conducted. The CryProcessor and BtToxin_scanner programs were used to search and classify genes encoding the Bt insecticidal toxins. As a result, a gene belonging to the cry1E group, cry1Ea7, was found. The toxins belonging to this group are characterized by activity against various Lepidoptera pests. It was found that the genome of the strain does not contain genes encoding Vip, Sip and Cyt. toxins, however, it harbors several genes encoding synthetases of non-ribosomally synthesized peptides (nrp) that may explain its multifunctional properties. Thus, considering the data obtained the liquid form of the biological preparation based on BtH10 56, can be recommended for use in the industry and organic farming.
Keywords: Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis, insecticidal activity, exotoxin, endotoxin, Oxford Nanopore, Illumina, Cry toxin, Bt, Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata.
1ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной |
Поступила в редакцию |
