doi: 10.15389/agrobiology.2019.1.178rus
УДК 579.64:632.9
Исследования выполнены согласно государственному заданию № 075-00376-19-00 Министерства науки и высшего образования РФ в рамках НИР по теме № 0686-2019-0013.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГРИБНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
ШТАММОВ Bacillus subtilis BZR 336g И Bacillus subtilis BZR 517
МОДИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ БИОАВТОГРАФИИ
Т.М. СИДОРОВА, А.М. АСАТУРОВА, А.И. ХОМЯК, Н.С. ТОМАШЕВИЧ
Способность Bacillus subtilis продуцировать разнообразные по структуре и свойствам биологически активные метаболиты в значительной степени обусловливает ее фунгицидный эффект в отношении особо опасных фитопатогенных грибов. В настоящей работе из культуральной жидкости штаммов B. subtilis BZR 336g и BZR 517 впервые выделены антигрибные метаболиты, подавляющие развитие вредоносных фитопатогенных грибов, изучены свойства и химическая структура этих соединений с использованием оригинальных аналитических подходов. Целью работы было обнаружение, описание и количественная оценка антифунгальной активности метаболитов у двух штаммов Bacillus subtilis — перспективных продуцентов биофунгицидов. Используемый нами методический подход включал очистку бактериальных метаболитов экстракцией этилацетатом, разделение методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах с силикагелем с УФ-визуализацией (λ = 366 нм), применение детектирующих реактивов, спектроскопию и биоавтографию. Модификация метода биоавтографии заключалась в использовании фитопатогенные грибы — возбудители вредоносных заболеваний сельскохозяйственных культур Fusarium oxysporum var. orthoceras BZRP1 и Alternaria sp. BZRP8 в качестве тест-объектов. Эксперименты выявили способность исследуемых штаммов B. subtilis накапливать комплекс активных метаболитов, проявляющих антигрибной эффект от фунгистатического до фунгицидного. Антигрибные соединения двух штаммов различались по подвижности при хроматографическом разделении и по характеру свечения в УФ-свете. Степень их воздействия на рост гриба также была различной. У штамма B. subtilis BZR 336g на хроматограмме обнаружены две наиболее выраженные зоны задержки роста F. oxysporum var. orthoceras BZRP1 с Rf 0,39 и 0,96. Значительное подавление роста Alternaria sp. BZRP8 также наблюдалось в двух зонах (Rf 0,42 и 0,96). Штамм B. subtilis BZR 517 синтезировал метаболиты, фунгитоксичные по отношению к F. oxysporum var. orthoceras BZRP1 (зоны с Rf 0,42; 0,84; 0,92; 0,96) и к грибу Alternaria sp. BZRP8 (зоны с Rf 0,42 и 0,96). Известно, что, помимо прямого действия, сурфактины и фенгицины B. subtilis предотвращают адгезию конкурентных микробов на растении. При опрыскивании пластин дистиллированной водой мы выявили несмачиваемые (гидрофобные) зоны, соответствующие компонентам, которые могут способствовать усилению антагонистических свойств B. subtilis. Использование детектирующих реагентов позволило выявить ароматические амины, фенолы, фенольные стероиды, метилгидразины. Слабое окрашивание исследованных метаболитов нингидрином, а также отсутствие характерного осадка при подкислении культуральной жидкости и добавлении сульфата аммония может свидетельствовать о присутствии незначительных количеств аминокислот и пептидов. У метаболитов пики поглощения находились в области λ = 205-217 нм, что может служить косвенным доказательством присутствия полиеновых структур. Поскольку детектирующие реактивы указывали на наличие разнообразных фенольных производных, а по данным многих исследователей активные штаммы при взаимодействии с фитопатогеном продуцируют гидролитические ферменты, можно предположить, что механизм действия метаболитов у изученных штаммов заключается в гидролизе фенольных соединений. В результате могут освобождаться активные группы фенолов, что способствует усилению антигрибной активности синтезируемых метаболитов за счет воздействия как на клеточные стенки, так и на другие структуры клетки фитопатогенного гриба.
Ключевые слова: Bacillus subtilis, микробиологические препараты, антигрибные метаболиты, фунгитоксичность,тонкослойная хроматография, биоавтография, детектирующие реактивы, фенольные соединения, полиеновые структуры.
Т.М. Sidorova, А.М. Asaturova, A.I. Homyak, N.S. Tomashevich
The ability of B. subtilis to produce a large number of biologically active metabolites of diverse structure and properties can largely determine its fungicidal effect against particularly dangerous pathogenic fungi. In this regard, we have studied the fungicidal activity and properties of the antifungal metabolites of active strains B. subtilis BZR 336g and BZR 517. The approach we used, inсluding purification by extraction with ethyl acetate, thin-layer chromatography (TLC), UV fluorescence, tests with detection reagents, spectroscopy and bioautography, showed the potential of the studied B. subtilis strains to accumulate the complex of active metabolites exhibiting antifungal effect from fungistatic to fungicidal. Bioautographic method was modified by use of the causative agents of harmful diseases, F. oxysporum var. orthoceras and Alternaria sp. as test organisms, which allowed us to assess in vitro the antifungal activity. Patterns of the antifungal compounds differed between the strains in TLC mobility and UV fluorescence. The impact on fungal growth also differed, from slight changes in mycelium growth to total suppression. In strain B. subtilis BZR 336g the most pronounced inhibition of F. oksysporum var. orthoceras BZRP1 growth was in bands with Rf 0.39 and 0.96. Significant Alternaria sp. BZRP8 growth inhibition was also observed in two bands, with Rf 0.42 and 0.96. B. subtilis BZR 517 synthesizes metabolites exhibiting fungitoxic properties in four bands with Rf 0.42, 0.84. 0.92 and 0.96 against F. oxysporum var. orthoceras BZRP1, and in two bands with Rf 0.42 and 0.96 against Alternaria sp. BZRP8. It is known that, in addition to the direct action, surfactins and fengicins of B. subtilis prevent the adhesion of competitive microbes on the plant. In out tests, spraying TLC plates with distilled water revealed bands with hydrophobic properties (non-wetting white zones), which can enhance the antagonistic effect of B. subtilis. Test with detection reagents visualized the presence of aromatic amines, phenols, phenolic steroids, methyl hydrazines, that is, compounds that probably play a certain role in the bioactivity manifestation. The weak staining of the metabolites with ninhydrin, as well as the absence of characteristic precipitation during acidification of the culture medium or adding ammonium sulfate, may indicate the presence of only minor amounts of amino acids and peptides. Spectrophotometrically we detected absorption peaks at 205-217 nm wavelengths, which indirectly evidences the presence of polyene structures. Our data allow us to hypothesize mechanisms underlying antifungal effects in the studied B. subtilis strains. These effects may be due to hydrolysis of phenolic compounds, since the detecting reagents indicate various phenolic derivatives, and, according to many researchers’ opinion, active strains, when interacting with a phytopathogen, produce hydrolytic enzymes. As a result, the active groups of phenols can be released, which enhances the antifungal activity of the synthesized metabolites via effect on both fungal cell walls and other cell structures.
Keywords: Bacillus subtilis, microbiological preparations, antifungal metabolites, fungitoxicity, thin-layer chromatography, bioautography, detection reagents, phenolic compounds, polyene structures.
ФГБНУ Всероссийский НИИ биологической |
Поступила в редакцию |
