Сельскохозяйственная биология, 2018, том 53, № 1, с. 189-200.
(для цитирования)

doi: 10.15389/agrobiology.2018.1.189rus

УДК 573.6.086.83:577.21:57.052

В работе использовано оборудование ЦКП «Аналитический центр нано- и биотехнологий ГОУ СПбГПУ» на базе ФГБОУ ВПО СПбГПУ. Исследования выполнены при финансовой поддержке РНФ (грант № 16-16-10043), часть исследований по разработке методов разделения деацетилированных хитоолигосахаридов поддержана РФФИ (грант № 15-29-05858-офи_м).

ПОЛУЧЕНИЕ ТЕРМИНАЛЬНО N-ДЕАЦЕТИЛИРОВАННЫХ
ОЛИГОМЕРОВ ХИТОЗАНА С ПОМОЩЬЮ РЕКОМБИНАНТНОЙ
ХИТООЛИГОСАХАРИДДЕАЦЕТИЛАЗЫ NodB Mesorhizobium loti,
ПРОДУЦИРУЕМОЙ Escherichia coli

И.В. ЛЕППЯНЕН¹, В.В. ДОЛГИХ², Т.О. АРТАМОНОВА³, С.А. ЛОПАТИН⁴,
М.А. ХОДОРКОВСКИЙ³, И.А. ТИХОНОВИЧ¹, Е.А. ДОЛГИХ¹

Олигомеры хитина и хитозана влияют на рост и развитие растений и способны индуцировать их устойчивость к заражению фитопатогенами, что определяет интерес к получению и использованию этих соединений. Влияние олигомеров хитозана на растение непосредственно зависит от степени их деацетилирования, но при гидролизе полимера или химическом синтезе трудно получить соединения необходимой структуры. Такие задачи могут быть решены в процессе биосинтеза хитоолигосахаридов, когда используются ферменты с определенной специфичностью. Избирательная способность хитоолигосахариддеацетилазы (КФ 3.5.1.-) почвенных ризобий осуществлять монодеацетилирование хитоолигосахаридов по терминальному положению обусловливает интерес к изучению возможности использования этого фермента для получения таких соединений. В настоящей работе нами предложены подходы для синтеза монодеацетилированной хитопентаозы (тетра-N-ацетилхитопентаозы) с помощью фермента хитоолигосахариддеацетилазы бактерий Mesorhizobium loti. При гетерологичной экспрессии гена nodB, кодирующего хитоолигосахариддеацетилазу M. loti CIAM1803, в штаммах Escherichia coli XL1-Blue-MRF’ и SHuffle express с помощью модифицированного вектора pOPE101mod-nodB с удаленной последовательностью pelB нам удалось получить фермент в растворимом состоянии. При этом количество растворимого фермента было выше в случае штамма SHuffle express, специально разработанного для обеспечения правильного формирования дисульфидных связей в синтезируемых белках. Изучение свойств фермента, очищенного на Ni-NTA агарозе, показало его способность деацетилировать пента-N-ацетилхитопентаозу по терминальному положению. Масс-спектрометрический анализ подтвердил использование практически всего субстрата для получения деацетилированной тетра-N-ацетилхитопентаозы. Были разработаны методы разделения и очистки деацетилированных хитоолигосахаридов с помощью ионообменной хроматографии с последующим обессоливанием. Синтез терминально N-деацетилированных олигомеров хитозана может быть необходимым этапом при получении их конъюгатов с биологически активными соединениями.

Ключевые слова: олигомеры хитина и хитозана, хитоолигосахариддеацетилаза Mesorhizobium loti, векторы pOPE101-215(Yol) и pRSETb, биосинтез, Escherichia coli SHuffle express и XL1-Blue MRF’.

Полный текст

PRODUCTION OF TERMINALLY N-DEACETYLATED OLIGOMERS
OF CHITOSANE USING RECOMBINANT CHITOOLIGOSACHARIDE
DEACETYLASE NodB OF BACTERIA Mesorhizobium loti EXPRESSED
IN Escherichia coli

I.V. Leppyanen¹, V.V. Dolgikh², T.O. Artamonova³, S.A. Lopatin⁴,
M.A. Khodorkovskii³, I.A. Tikhonovich¹, E.A. Dolgikh¹

Chitin and chitosan oligomers affect the growth and development of plants and are able to induce plant resistance to infection with phytopathogens, which determines the interest in the preparation and use of these compounds. The influence of chitosan oligomers on the plant directly depends on the degree of deacetylation, but it is difficultly to obtain compounds with necessary structure using hydrolysis of the polymer or chemical synthesis. Such problems can be solved in the process of biosynthesis of chitooligosaccharides, when enzymes with specific activity are used. The selectivity of the chitooligosaccharide deacetylase (EC 3.5.1.-) of rhizobia to carry out the mono-deacetylation of the chitooligosaccharides at the terminal position of the molecule causes interest in studying the possibility to use this enzyme for the synthesis of such compounds. In current work we have developed approaches for the synthesis of mono-deacetylated chitopentaose (tetra-N-acetylchitopentaose) using Mesorhizobium loti CIAM1026 enzyme chitooligosaccharide deacetylase. Heterologous expression of the nodB gene encoding the M. loti chitooligosaccharide deacetylase in Escherichia coli XL1-Blue MRF' and SHuffle express strains using the modified pOPE101mod-nodB vector with deleted pelB sequence resulted in soluble enzyme preparation. The amount of soluble enzyme was higher in SHuffle express strain, which was specially developed for correct formation of disulfide bonds in synthesized proteins. Studying the properties of the enzyme purified on Ni-NTA agarose showed its ability to deacetylate penta-N-acetylchitopentaose at the terminal position. Mass spectrometric analysis confirmed the use of practically the entire substrate for the preparation of deacetylated tetra-N-acetylchitopentaose. Methods for the separation and purification of deacetylated chitooligosaccharides by ion exchange chromatography followed by desalination have been developed. Synthesis of terminally N-deacetylated chitosan oligomers may be a necessary step in the preparation of their conjugates with biologically active compounds.

Keywords: chitin and chitosan oligomers, Mesorhizobium loti chitooligosaccharide deacetylase, pOPE101-215(Yol) and pRSETb vectors, biosynthesis, Escherichia coli SHuffle express and XL1-Blue MRF’.