doi: 10.15389/agrobiology.2018.1.201rus

УДК 579.64:632.937.15

Работа поддержана проектом прикладных научных исследований и экспериментальных разработок (ПНИЭР) по лоту шифр 2017-14-579-0030 по теме: «Создание микробиологических препаратов для расширения адаптационного потенциала сельскохозяйственных культур по питанию, устойчивости к стрессам и фитопатогенам» (шифр заявки 2017-14-579-0030-013), соглашение № 14.607.21.0178, уникальный идентификатор работ (проекта) RFMEFI60717X0178.

 

АКТИВНОСТЬ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ Bacillus thuringiensis var. israelensis ПРИ РАЗНЫХ МЕТОДАХ ХРАНЕ-НИЯ

В.П. ЕРМОЛОВА, С.Д. ГРИШЕЧКИНА, А.А. НИЖНИКОВ

Микробиологический метод борьбы с вредными насекомыми служит альтернативой применению химических пестицидов. Основу энтомоцидных биопрепаратов составляют микроорганизмы, обладающие стабильно высокими показателями эффективности против вредителей. Целью настоящего исследования было изучение культуры штаммов Bacillus thuringiensis var. israelensis (BtH14) на жизнеспособность, продуктивность и ларвицидность при хранении различными методами. Штамм 266/2 хранился на мясопептонном агаре (МПА) и в трупах комаров Culex pipiens molestus 1 год, в кристаллах NaCl 1,5 года; штамм 71 — на МПА 1 год без пересева, 2 года с пересевом через 6 мес; штамм 87а — методом криоконсервации 10 лет; штаммы 87, 404, 19/43 — в лиофильно высушенном состоянии 28 лет; штаммы 7-1/23, 71/82, 19/1 — в кристаллах NaCl 27 лет. Культуру штаммов BtH14 выращивали на скошенном МПА при температуре 28-30 °С в течение 5-7 сут до полного образования спор и кристаллического эндотоксина. При хранении BtH14 методом лиофилизации биомассу споровой культуры в пробирке на скошенном МПА смывали 5 мл 20 % раствора NaCl. По 0,5 мл полученной суспензии с титром 107-108 КОЕ/мл вносили пастеровской пипеткой в стеклянные ампулы, закрывали стерильным тампоном, затем стерильной пробкой и замораживали в холодной ванне при температуре -22 °С в течение 1 ч, высушивали при -45 °С в течение 23 ч, запаивали под вакуумом над газовой горелкой и хранили в холодильнике при 3-5 °С. При хранении BtH14 в кристаллах NaCl в пробирку со споровой культурой на скошенном МПА вносили 5 мл 0,9 % физиологического раствора, тщательно растирали петлей до получения гомогенной взвеси, по 0,5 мл вносили в стерильные биологические пробирки, закрывали ватно-марлевыми пробками и хранили при комнатной температуре. При хранении методом криоконсервации споровую культуру BtH14 суспендировали в мясопептонном бульоне (МПБ) с 10 % глицерина. Полученные суспензии (по 200 мкл) разливали в криопробирки и хранили при -80 °С. Титр BtH14 и ларвицидную активность для комаров Aedes aegypti определяли 1-2 раза в год. Исследования показали, что культура штамма 266/2 через 1 год хранения в трупах комаров C. pipiens molestus и на МПА диссоциировала с образованием колоний IV морфотипа S-формы (соответственно 0,8 и 1,6 %), утратившего активность для комаров A. aegypti. Титр спор и ларвицидность штамма 71 через 1 год хранения на МПА в пробирках с запарафинированными пробками сохранялись на исходном уровне. При пересеве через каждые 6 мес эти показатели снизились соответственно на 12 и 16 % через 1 год, на 25 и 27 % — через 2 года хранения. Криоконсервация штамма 87а обеспечила стабильность титра и ларвицидной активности через 10 лет. Исходный титр и ларвицидная активность были соответственно 2,74×109 КОЕ/мл и 0,178×10-3 %. Через 6 и 10 лет они составляли 2,82×109 КОЕ/мл и 0,19×10-3 %; 2,72×109 КОЕ/мл и 0,18×10-3 %. Через 27 лет хранения в кристаллах NaCl титры штаммов BtH14 7-1/23, 71/82, 19/1 и ЛК50 для комаров A. aegypti варьировали в пределах 3,12×109-3,52×109 КОЕ/мл и 0,135×10-3-0,150×10-3 % при исходных значениях соответственно 3,98×109-4,29×109 КОЕ/мл и 0,10×10-3-0,11×10-3 %. Титры и ларвицидная активность штаммов 87, 404, 19/43, которые хранили методом лиофильного высушивания, оставались в пределах 3,32×109-3,68×109 КОЕ/мл и 0,11×10-3-0,14×10-3 % при исходных значениях 3,86×109-4,45×109 КОЕ/мл и 0,087×10-3-0,103×10-3 %. Таким образом, лучшие показатели для BtH14 получены при хранении в лиофильно высушенном состоянии, в кристаллах NaCl и с использованием криоконсервации.

Ключевые слова: Bacillus thuringiensis var. israelensis (BtH14), хранение, титр, ларвицидная активность.

 

Полный текст

 

 

ACTIVITY OF INSECTICIDAL Bacillus thuringiensis var. israelensis
STRAINS STORED BY VARIOUS METHODS

V.P. Ermolova, S.D. Grishechkina, A.A. Nizhnikov

Microbiological method of insecticidal pests control is an alternative to chemical pesticides. Insect control agents are based on different microorganisms, which should be stably effective against target pest organism. There are different origins of industrial strains including isolation from natural objects, screening of collections, selection of existing strains, genetic engineering etc. but in all cases beneficial features of the strains should be preserved. In this article, the problems of preserving beneficial features of insecticidal bacteria Bacillus thuringiensis var. israelensis (BTH14) are discussed. This strain is effective as the pest control agent against larvae of mosquitoes, midges and rice and champignons mosquitoes. Different methods and time of storage of various BTH14 strains are shown: 266/2 on meat-peptone agar (MPA) and in corpse of mosquitoes for one year, in sodium chloride crystals for one and a half year; 71 on MPA without reseeding for one year and for two years with reseeding every six months; 87a by cryopreservation for ten years; 87, 404, 19/43 as lyophilized bacteria for 28 years; 7-1/23, 71/82, 19/1 in sodium chloride crystals for 27 years. Culture of BTH14 strain was grown on MPA slants at 28-30 °C for 5-7 days until reaching the complete formation of spores and endotoxin crystals. Microscopic analysis was carried out with aniline black dye. Morphological analysis of colonies was performed with colony-purified BTH14. When BtH14 was stored by the lyophilization method, the spore culture in a tube on a slant MPA was washed with 5 ml of a 20 % NaCl solution. Then 0.5 ml of the resulting suspension with a titer of 107-108 CFU/ml was added with a Pasteur pipette into glass ampoules, covered with a sterile swab, then sterile stopper and frozen in a cold bath at a temperature of -22 °C for 1 hour, dried at -45 °C for 23 hours, sealed under vacuum over a gas burner and stored in a refrigerator at 3-5 °C. When using the BtH14 storage method in NaCl crystals, 5 ml of 0.9 % saline was added to a tube with spore culture on slant MPA, resuspended, and 0.5 ml of suspension was added to sterile tubes, covered with cotton-gauze stoppers and stored at room temperature. When BtH14 was stored by cryopreservation, the spore culture of BtH14 was suspended in meat-peptone broth (MBP) with 10 % glycerol. The resulting suspensions (200 μl each) were poured into cryovials and stored at -80 °C. The BtH14 titer and larvicidal activity for Aedes aegypti mosquitoes were measured once or twice per year. The results showed that the culture of the 266/2 strain after a year of storage in the corpses of mosquitoes Culex pipiens molestus or on MPA dissociated with the formation of 0.8 and 1.6 % of the IV S form morphotype which lost activity against A. aegypti mosquitoes. The titer of the spores and the larvicidity of the 71 strain were at the initial level after one year of storage on MPA in tubes with paraffinized plugs when reseeded every 6 months. These indicators decreased, respectively, by 12 and 16 % in a year and by 25-27 % after 2 years of storage. Cryopreservation of the 87a strain provided stability of titer and larvicidal activity after 10 years. Thus, the initial titer and larvicidal activity expressed as LC50 for A. aegypti mosquitoes were 2.74×109 CFU/ml and 0.178×10-3 %, respectively. After 6 and 10 years, they corresponded to the following indicators: 2.82×109 CFU/ml and 0.19×10-3 %; 2.72×109 CFU/ml and 0.18×10-3 %. The BtH14 strains 7-1/23, 71/82, and 19/1 were stored in NaCl crystals. After 27 years of storage, their titers and LC50 for A. aegypti mosquitoes varied within the range of 3.12×109-3.52×109 CFU/ml and 0.135×10-3-0.150×10-3 % as compared to the initial values that were 3.98×109-4.29×109 CFU/ml and 0.10×10-3-0.11×10-3 %, respectively. The 87, 404, and 19/43 strains were stored by the method of freeze drying. After 28 years, their titers and larvicidal LC50 for A. aegypti mosquitoes remained within 3.32×109-3.68×109 CFU/ml and 0.11×10-3-0.14×10-3 % as compared to the initial values 3.86×109-4.45×109 CFU/ml and 0.087×10-3-0.103×10-3 %, respectively. Thus, the best indicators for preservation of valuable properties of BtH14 were obtained when stored in a lyophilized state, in NaCl crystals and using cryopreservation.

Keywords: Bacillus thuringiensis var. israelensis (BtH14), titer, storage, larvicidal activity.

 

ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной 
микробиологии, 
196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,

e-mail: Ermolovavalya1940@mail.ru ✉ , svetagrishechkina@mail.ru, ant.nizhnicov@gmail.com

Поступила в редакцию
20 декабря 2017 года

 

назад в начало