УДК 631.461.5:575

ОЦЕНКА ФЕНОТИПИЧЕСКОГО ПРОЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТИВНОСТЬ АЗОТФИКСИРУЮЩЕГО СИМБИОЗА С РАСТЕНИЯМИ

О.П. ОНИЩУК, Н.А. ПРОВОРОВ, Н.И. ВОРОБЬЕВ, Б.В. СИМАРОВ

С использованием набора рекомбинантных штаммов клубеньковых бактерий люцерны (Sinorhizobium meliloti) с дополнительными копиями генов транспорта дикарбоновых кислот (процесс, лимитирующий азотфиксацию), показано, что их симбиотическая эффективность ограничена неспособностью растений к полному вовлечению биологического азота в ростовые процессы, и в частности к передаче в надземные органы транспортных форм азота, накопление которых в корнях и клубеньках ингибирует поступление энергии в бактероиды. По данным факторного анализа результатов вегетационных опытов, амплификация структурного гена сукцинатпермеазы dctA в комплексе со специфичными транскрипционными регуляторами dctBD повышает симбиотическую эффективность вне зависимости от сорта растений и условий вегетации, тогда как амплификация генов nifA и ntrA (неспецифичные регуляторы гена dctA) требуется для увеличения N2-фиксирующей активности только в неблагоприятных для нее условиях.

Ключевые слова: симбиотическая азотфиксация, клубеньковые бактерии, бобовые растения, генетическое конструирование, дикарбоновые кислоты, факторный анализ, эффективность симбиоза, конкурентоспособность, экологически безопасное земледелие.

 

Генетическое конструирование и внедрение в растениеводство высокоэффективных симбиотических азотфиксаторов сдерживаются низкой воспроизводимостью фенотипа «повышенная эффективность симбиоза», обусловленной влиянием на него условий вегетации и генотипов растений-хозяев, сорта которых обычно характеризуются высоким полиморфизмом, нивелирующим генотипические различия микросимбионтов.

П е р с п е к т и в ы  и  о г р а н и ч е н и я  г е н е т и ч е с к о-
г о  к о н с т р у и р о в а н и я  с и м б и о т и ч е с к и х  а з о т ф и к-
с а т о р о в. Симбиозы растений с азотфиксирующими бактериями имеют огромное экологическое и сельскохозяйственное значение как источники биологического азота для экологически безопасных систем земледелия и растениеводства (1-3). Наиболее эффективны морфологически оформленные симбиозы растений с ризобиями (бобовые), с актиномицетами Frankia (актиноризы, образуемые двудольными, относящимися к группе Rosid I) и с цианобактериями Nostoc (синцианозы, характерные для низших растений, а также для некоторых голосеменных и цветковых). Большим агрономическим потенциалом обладают симбиозы растений с ризосферными и эндофитными азотфиксаторами (Azoarcus, Azospirillum, Flavobacterium,Gluconacetobacter), которые взаимодействуют со многими зерновыми и овощными культурами (4). Благодаря этим симбиозам большинство сельскохозяйственных культур миксотрофны в отношении азотного питания, однако соотношение симбиотрофного и автономного (автотрофного) питания азотом широко варьирует в зависимости от вида и сорта растений (5, 6).

Перспективную модель для генетико-селекционных работ по повышению интенсивности симбиотической азотфиксации представляет собой бобово-ризобиальный симбиоз, который подробно изучен на молекулярном, генетическом, морфофизиологическом и экологическом уровнях (4). С помощью методов мутагенеза, гибридизации и генетической инженерии были получены штаммы ризобий, обладающие повышенной симбиотической активностью (7-10), однако их практическое использование ограничено неполным проявлением наследственных факторов эффективности симбиоза, что связано с утратой культурными растениями симбиотических функций (5) и низкой воспроизводимостью фенотипа «повышенная эффективность симбиоза», обусловленной неконтролируемым варьированием факторов среды, а также высоким полиморфизмом сортовых популяций.

Конструирование штаммов клубеньковых бактерий (ризобий) с повышенной азотфиксирующей активностью включает активацию генных систем, контролирующих ключевые стадии симбиоза, а также инактивацию негативных регуляторов симбиоза.


Рис. 1. Симбиотическая регуляция dct-генов, ответственных за транспорт дикарбоновых кислот в ризобии люцерны (Sinorhizobiummeliloti): DctA — сукцинатпермеаза, DctB и DctD — белки двухкомпонентной регуляторной системы (DctD* представляет собой фосфорилированную форму DctD), RpoN — s54-субъединица РНК-полимеразы, активирующая промоторы nif-генов; ASA — гипотетический регулятор растительной природы, участвующий в активации промотора гена dctA при симбиозе (18).

А к т и в а ц и я  г е-
н о в  с и м б и о т и ч е-
с к о й  а з о т ф и к с а ц и и.Для повышения симбиотической активности ризобий модификациям подвергаются ге-ны, контролирующие сигналь-ное взаимодействие с хозяином и развитие клубеньков (nod/nol/noe) (11), конкуренцию за инфицирование растений (cmp) (12), а также гены, кодирующие нитрогеназу и обслуживающие ее ферменты (nif/fix) (13, 14). Молекулярно-генетический анализ ризобий показал, что эффективность симбиоза (ЭС), которую обычно определяют, как влияние инокуляции на продуктивность растений (1, 15), зависит не только от азотфик-сирующей активности бактерий, но и от их совместимости с системами гомеостаза растительного организма и с его метаболическими возможностями. Например, утрата симбиотической азотфиксации характерна для бактерий, мутантных по структуре экзо- и липополисахаридов, которые подавляют защитные реакции растений, а также по ферментам цикла Кребса, обеспечивающим утилизацию бактериями дикарбоновых кислот (сукцинат, малат), поставляемых растением.

Перспективный способ повышения нитрогеназной активности бактерий — улучшение энергоснабжения бактероидов за счет транспорта в них дикарбоновых кислот (ДК). Этот транспорт контролируется сукцинатпермеазой DctA, синтез которой зависит от специфичных для гена dctA регуляторов DctBD, активирующих транскрипцию dctA в присутствии ДК, и от неспецифичных регуляторов NifA и NtrA, вовлеченных также в активацию синтеза нитрогеназы (рис. 1). Амплификация перечисленных генов приводит к существенному (в 2-3 раза) повышению азотфиксирующей активности, регистрируемому в лабораторных условиях (16-18). Хотя непосредственное практическое применение полученных рекомбинантов ограничено их нестабильностью в полевых условиях (19), они могут быть использованы как модель для выявления генетических и физиологических факторов, ограничивающих азотфиксацию.

Кроме активации нитрогеназной системы, для повышения эффективности симбиоза необходимо обеспечить проникновение сконструированных штаммов ризобий в клубеньки. Оно зависит от конкурентоспособности (КС), которую контролируют многочисленные cmp-гены, расположенные в разных участках генома ризобий, включая плазмиды и хромосомы (13, 20-22). Некоторые cmp-гены выполняют функции, важные для выживания бактерий в почве или ризосфере (скорость роста, устойчивость к антибиотикам или фагам, молекулярная архитектура клеточной поверхности, использование почвенных и ризосферных источников питания). Однако генетический анализ не позволил выявить прямой связи КС с азотфиксирующей активностью. Так, мутанты ризобий сои (Bradyrhizobiumjaponicum) по nif-генам, которые этой активности лишены, не отличаются по КС от родительского штамма (23), а обладающие высокой конкурентоспособностью штаммы B. japonicum серогруппы 123, доминирующие в почвах США, обычно проявляют низкую или нулевую азотфиксирующую активность (24).

Представленные данные о независимости генетического контроля азотфиксирующей активности и КС указывают на необходимость и возможность объединения факторов, контролирующих высокую степень проявления этих признаков, в генотипах производственных штаммов ризобий. Генетические факторы, которые могут быть использованы для решения этой задачи, описаны многими авторами. Например, у штамма 1-32 R. leguminosarum bv. viceae выявлена Sym-плазмида (270 т.п.н.), контролирующая высокую азотфиксирующую активность и КС при взаимодействии с викой, а также кислотоустойчивость, проявляемую в жидкой среде (25). У ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti) выявлен важный для проявления КС локус nfe, который обычно находится на плазмидах размером 150-200 т.п.н., благодаря чему может активно распространяться в популяциях (26).

Ряд cmp-генов изучили на предмет экспрессии при переносе в штаммы ризобий с высокой азотфиксирующей активностью. Наиболее полный цикл работ выполнен с tfx-генами ризобий клевера, кодирующими синтез олигопептидного антибиотика трифолиотоксина, состоящего из 10 аминокислот (27). Эти гены были обнаружены у штамма ТА1, который образует с клевером неактивный (Fix-) симбиоз, а при совместной инокуляции со штаммами-азотфиксаторами блокирует их проникновение в клубеньки. Перенос tfx-генов в азотфиксирующие штаммы ризобий клевера вызывал у них увеличение КС, причем продукция трифолиотоксина не влияла на нитрогеназную активность. Более того, перенос этих генов в неродственные виды (ризобии фасоли или люцерны) приводил к появлению синтеза трифолитоксина и, как следствие, к повышению способности бактерий конкурировать за инфицирование соответствующих растений (27, 28).

Однако многие cmp-гены не проявляются вне взаимодействия с растениями, и для их идентификации необходим прямой отбор мутантов по признаку КС в вегетационных опытах. Используя транспозоновый (Tn5) мутагенез, мы получили серию мутантов по таким генам у ризобий люцерны (29), после чего маркированные транспозоном последовательности ДНК были использованы для клонирования аллелей дикого типа. Перенос этих аллелей в штамм СХМ1-105 ризобий люцерны, активно фиксирующий азот, позволил существенно повысить его КС (30).

И н а к т и в а ц и я  н е г а т и в н ы х  р е г у л я т о р о в  с и м-
б и о з а.Такие регуляторы впервые были выявлены у ризобий лядвенца (Mesorhizobium loti) на криптической плазмиде размером 240 МДа, утрата которой повышает одновременно ЭС и КС (31).У Sinorhizobium meliloti при анализе Tn5-мутантов, отобранных по способности повышать массу инокулированных растений люцерны, обнаружена серия наследственных факторов — негативных регуляторов симбиоза (32, 33). Определение первичной структуры этих факторов (eff-генов) показало, что ни один из них не связан непосредственно с работой нитрогеназы (33, 34). Некоторые из eff-генов контролируют транспорт сахаров в бактериальные клетки (34), в связи с чем инактивация этих генов может повышать скорость поглощения бактериями ДК. Аналогичный результат возможен при инактивации генов аденилатциклазы (35), которая снимает катаболитную репрессиию, ограничивающую утилизацию многих С-соединений. Один из выявленных у S. meliloti eff-генов блокирует деполимеризацию кислых экзополисахаридов (35), которые способствуют преодолению защитных реакций хозяина, ограничивающих размножение ризобий в клубеньках.

Следовательно, анализ eff-генов показал, что признак ЭС может быть улучшен как за счет повышения азотфиксирующей активности, так и посредством оптимизации функций, отвечающих за совместимость бактерий с защитными и метаболическими системами растения-хозяина.

Ф и з и о л о г и ч е с к и е  о г р а н и ч е н и я  Э С  с о  с т о р о-
н ы  р а с т е н и й. В качестве модели для выявления физиолого-генетических факторов, ограничивающих проявление фенотипа «повышенная ЭС», мы использовали набор рекомбинантных штаммов ризобий люцерны (S. meliloti) с дополнительными копиями генов транспорта ДК — основного энергетического субстрата, передаваемого растением в N2-фикси-рующие бактероиды (табл. 1).

1. Характеристика рекомбинаных штаммов ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti), полученных при введении дополнительных генов транспорта дикарбоновых кислот в штамм Rm2011 в составе интерактивных и репликативных векторов

Штамм

Введенный вектор

Копийность генов, балл

dctABD

dctA

nifA

ntrA

2011-121

pRmSC121

3

3

1

1

2011-121H6

pRmSC121H6

4

4

1

1

2011-121SH2

pRmSC121SH2

1

3

1

1

2011-121HB4

pRmSC102HB4

1

1

1

2

2011-121HH5

pWKR56IHH5

1

1

3

1

2011-121/121SH2

pRmSC121 + pRmSC121SH2

3

5

1

1

2011-H6/SH2

pRmSC121H6 + pRmSC121SH2

4

6

1

1

2011-SH2/HB4

pRmSC121SH2 + pRmSC102HB4

1

3

1

2

2011-SH2/HH5

pRmSC121SH2 + pWKR56IHH5

1

3

3

1

Rm2011 (дикий тип)

Отсутствует

1

1

1

1

П р и м е ч а н и е. Наличие исходной копии гена в штамме дикого типа — 1 балл, введение копии в составе интегративного и репликативного вектора — соответственно 1 и 3 балла дополнительно (36).

Испытание этих штаммов в стерильных вегетационных опытах (растения выращивали на вермикулите с безазотной средой до стадии цветения) показало (табл. 2), что средняя прибавка по накоплению азота в надземной части люцерны сорта Du Puits в 4 раза выше, чем по массе (соответственно +69,4 и +17,9 %), причем увеличение содержания азота в растениях составляет +44,1 % (36). Таким образом, основная часть дополнительно фиксируемого бактериями азота расходуется не на формирование биомассы растений, а на ее обогащение азотом. Аналогичные результаты были получены при инокуляции гороха, вики, маша и арахиса высокоактивными штаммами ризобий (37-39).

Эти данные показывают, что симбиотрофное азотное питание бобовых включает два процесса — обогащение растений азотом, приводящее к оптимизации соотношения N:C, и увеличение их биомассы. Соотношение этих процессов зависит от генотипов партнеров и влияния факторов среды,

2. Показатели симбиотической активности у рекомбинантных штаммов Sino-rhizobium meliloti, несущих дополнительные копии генов транспорта дикарбоновых кислот, с растениями люцерны сорта Du Puits (вегетационный опыт) (г. Санкт-Петербург—Пушкин, 2002 год)

Штамм

M

N

2011-1211

+6,70

+36,9 (+)

2011-121Н61

+49,70 (+)

+87,3 (+)

2011-121SH21

+28,40

+88,4 (+)

2011-121/121SH21

+39,30 (+)

+126,6 (+)

2011-H6/SH21

+5,10

+47,5 (+)

2011-121HB41

+37,20 (+)

+83,4 (+)

2011-SH2/HB41

+2,70

+72,3 (+)

2011-121HH51

-7,20

+22,9 (+)

2011-SH2/HH51

-0,80

+59,2 (+)

Rm2011 (дикий тип)2

59,90

910,0

Контроль (без
инокуляции)2

32,50

315,0

НСР0,052

20,24

200,2

П р и м е ч а н и е. 1 — отклонения (%) от показателя в варианте с инокуляцией штаммом Rm2011; 2 — сухая надземная масса растений (М), г/сосуд; N — общее накопление азота в надземной массе, мг/сосуд; (+) — достоверные прибавки.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

в первую очередь от доступности связанного азота (4). Следовательно, для повышения эффективности симбиотрофного азотного питания растений необходимо выяснить, какие физиологические и генетические факторы ограничивают использование фиксированного ризобиями азота для формирования дополнительной биомассы.

Мы предположили, что причина ограничения продуктивности люцерны, инокулированной рекомбинантами S. meliloti, состоит в том, что значительная часть фиксируемого азота задерживается в корнях. По данным Л.М. Доросинского (1), при образовании эффективного симбиоза у люцерны, люпина и клевера содержание азота в корнях повышается соответственно на 35, 72 и 44 %, в надземной части — на 29, 30 и 33 %.

3. Показатели продуктивности растений и накопление азота (N) и углерода (C) в биомассе у разных сортов люцерны при инокуляции рекомбинантными штаммами Sinorhizobium meliloti с дополнительными копиями генов транспорта дикарбоновых кислот (микровегетационный опыт 2) (г. Санкт-Петербург—Пушкин, 2002 год)

Показатель

Надземная часть

Корневая система

сорт Зайкевича

сорт Du Puits

сорт Зайкевича

сорт Du Puits

О т к л о н е н и е  о т  к о н т р о л я  п р и  и н о к у л я ц и и  
р о д и т е л ь с к и м  ш т а м м о м  R m 2 0 1 1  (д и к и й  т и п),  %  

MИ

+31,4 (+)

+36,0 (+)

-41,9 (-)

-61,6 (-)

N

+115,2 (+)

+130,0 (+)

-45,5 (-)

-35,5 (-)

C

+23,4 (+)

+23,3 (+)

-60,0 (-)

-54,4 (-)

О т к л о н е н и е  о т  п о к а з а т е л я  д л я  шт а м м а  R m 2 0 1 1  
п р и  и н о к у л я ц и и
р е к о м б и н а н т н ы м и  ш т а м м а м и

MИ

+9,5 (+)

+15,3 (+)

-8,5

+54,3 (+)

N

+10,9 (+)

+8,7

+23,6 (+)

+57,5 (+)

C

+1,3

+14,2 (+)

+9,0

+53,6 (+)

А б с о л ю т н ы е  з н а ч е н и я  м а с с ы,  мг на пробирку

MК

10,5

10,0

8,7

11,2

MИ (Rm2011)

13,8

13,6

5,1

4,3

П р и м е ч а н и е. МИ и МК — соответственно сухая масса в варианте с инокулированными и контрольными (не инокулированными) растениями; (+) и (-) — отклонения статистически значимы (P0 < 0,05).

В условиях микровегетационных опытов (МВО) мы изучили накопление биомассы, азота и углерода в корнях и надземной части растений у двух неродственных сортов люцерны — Du Puits (Medicagosativa)и сорта Зайкевича (M. varia), инокулированных штаммом S. meliloti Rm2011 и рекомбинантами с дополнительными копиями генов транспорта ДК (35).

Оказалось (табл. 3), что при инокуляции родительским штаммом у обоих сортов возрастает надземная масса, а также накопление в ней N и C, что сопровождалось сдвигом соотношения N:С в пользу азота (рис. 2) вследствие интенсивного оттока углерода в клубеньки. При инокуляции штаммом Rm2011 у обоих сортов наблюдали значительное снижение массы


Рис. 2. Изменение содержания азота (N) и углерода (C) в корнях (К) и надземной части (Н) растений люцерны сортов Зайкевича (а) и Du Puits (б) при симбиозе с Sinorhizobium meliloti(микровегетационный опыт). Представлены средние отклонения (со стандартными ошибками) от контроля (без инокуляции), принятого за 0 (по 10 эффективным штаммам, указанным в табл. 1).

корней (см. табл. 3), причем у сорта Du Puits количество азота в корнях увеличивалось более резко. Обнаруженные различия между сортами люцерны проявлялись и при взимодействии с рекомбинантами, несущими дополнительные копии генов транспорта ДК: у обоих сортов возрастала надземная масса растений и содержание в ней азота (см. табл. 3), однако наблюдаемые прибавки были невелики и сопровождались накоплением дополнительно фи-ксируемого азота в корнях соответственно на 31,0 и 62,0 % от общего количества азота у сортов Зайкевича и Du Puits. Важно отметить, что у сорта Du Puits в корнях повышалось содержание углерода (на 5,2 %), который поступил из

 


Рис. 3. Соотношение массы надземной части (Н) и корней (К) у растений люцерны разных сортов при возрастании эффективности симбиоза с Sinorhizobium meliloti(микровегетационный опыт): а, б и в — соответственно контроль (без инокуляции), инокуляция родительским штаммом Rm2011 (дикий тип) и инокуляция рекомбинантными штаммами. Для контроля и варианта с инокуляцией родительским штаммом средние значения со стандартными ошибками приведены по повторностям, для рекомбинантов — по группе из 9 штаммов.

надземной части и был использован для ассимиляции азота. При этом количество азота в корнях увеличилось на 1,3 %, что соответствует соотношению N:C в транспортных формах азота (ТФА) — амидах и аминокислотах. Очевидно, что у сорта Du Puits резко ограничен переход образующихся в клубеньках ТФА в надземную часть растений. У сорта Зайкевича, наоборот, фиксированный азот активно переходит в надземную часть, о чем свидетельствует снижение (на 9,2 %) количества углерода, входящего в состав ТФА, в корнях. При сравнении двух сортов люцерны по биомассе и накоплению азота достоверные корреляции наблюдаются для надземной части (r = +0,61…+0,87; P0 = 0,01-0,05), однако отсутствуют для корней. По-видимому, генетические различия, выявляемые между сортами по активности симбиоза, определяются особенностями биохимических процессов в корнях (например, образования ТФА или их переноса из N2-фиксирующей зоны клубенька в проводящие сосуды).

Важные для симбиоза различия в динамике развития были выявлены и при анализе соотношения массы надземной части и корней (Н:К): у сорта Зайкевича оно увеличивается по мере возрастания симбиотической активности бактерий, у сорта Du Puits — повышается при формировании эффективного симбиоза с родительским штаммом Rm2011, но снижается при росте эффективности симбиоза, связанном с амплификацией генов транспорта ДК (рис. 3). Ранее было показано, что у клевера переменчивого (Trifolium ambiguum) — вида с преимущественно симбиотрофным азотным питанием (5) — при образовании высокоэффективного, малоэффективного и неэффективного симбиоза с ризобиями соотношение Н:К составляет соответственно 2,21; 1,10 и 0,53-0,60 (40). У люпина при эффективном симбиозе с ризобиями соотношение Н:К возрастает с 10,9 до 12,9 (1).

М а т е м а т и ч е с к а я  о ц е н к а  ф е н о т и п а  «п о в ы ш е н-
н а я  Э С». Сельскохозяйственное использование генно-инженерных штаммов ризобий ограничено не только неполной экспрессией генов ЭС, но и высокой степенью варьирования этого признака, которое может быть как генетическим (вызвано полиморфизмом растительной популяции), так и связанным с условиями среды. Действительно, сорта бобовых культур обычно представлены полиморфными популяциями, на фоне которых количественные признаки симбиоза варьируют очень широко (41, 42). Двухфакторный дисперсионный анализ данных о взаимодействии различных генотипов бактерий и растений выявил высокий вклад неконтролируемого варьирования в симбиотическую эффективность (обычно превосходящий вклады любого из партнеров, а иногда и их суммарные эффекты), причем основным источником такой изменчивости оказался именно полиморфизм растительных популяций (43).

4. Коэффициенты корреляции показателей эффективности симбиоза растений разных сортов люцерны с высокоэффективными рекомбинантными штаммами Sinorhizobiummelioti, содержащими дополнительные гены транспорта дикарбоновых кислот (микровегетационные и вегетационный опыты) (г. Санкт-Петербург—Пушкин, 2002 год)

Показатель

Растения сортов Du Puits и Зайкевича в МВО2

Растения сорта Du Puits в разных опытах

МВО1 и МВО2

МВО1 и ВО

МВО2 и ВО

Сухая масса растения, г

+0,49

+0,65*

-0,53

-0,29

Содержание N, %

+0,61*

-0,05

+0,02

-0,25

Абсолютное количество N, мг/растение

+0,87**

-0,13

+0,40

+0,14

П р и м е ч а н и е. МВО1 и МВО2 — микровегетационные опыты (36), ВО — вегетационный опыт (см. табл. 2).
* и ** Достоверно соответственно при P0 < 0,05 и P0 < 0,01.

Сопоставление результатов независимых опытов по изучению фенотипа рекомбинантов с дополнительными копиями генов транспорта ДК показало низкую воспроизводимость величин ЭС, проявляемых на сорте Du Puits (табл. 4). Достоверную корреляцию удалось обнаружить только по массе растений (контролируемой в основном сортовым генотипом) при сопоставлении результатов двух микровегетационных опытов (МВО). По признакам накопления азота, определяемым в равной степени растительным и бактериальным генотипами, корреляции отсутствовали при всех сравнениях. В то же время при испытании на разных сортах (Du Puits и Зайкевича) в одном из микровегетационных опытов совпадение результатов было значительным, особенно по накоплению азота, которое контролируется бактериальным генотипом в гораздо большей степени, чем масса растения.

Для достоверной оценки симбиотических фенотипов рекомбинантных штаммов бактерий мы использовали метод факторного анализа, который по совокупности данных нескольких опытов позволяет выявить вклады отдельных генов, модифицированных с помощью молекулярных методов, в определение признаков ЭС (масса растений, накопление в них азота и углерода) даже при низкой воспроизводимости симбиотического фенотипа бактерий (36). Оказалось, что в МВО с сортом Du Puits совместная амплификация структурного гена сукцинатпермеазы dctA и его специфичных регуляторов dctBD в большей степени влияла на параметры симбиотической эффективности, чем амплификация гена dctA или его неспецифичных регуляторов nifA и ntrA(табл. 5).

5. Факторные нагрузки, характеризующие степень влияния амплифицированной копии генов транспорта дикарбоновых кислот на эффективность симбиоза Sinorhizobiummeliloti с разными сортами люцерны (микровегетационные и вегетационный опыты) (г. Санкт-Петербург—Пушкин, 2002 год) (36)

Ген

Сорт Du Puits

Сорт Зайкевича

МВО1

МВО2

ВО

МВО2

dctABD

0,72а

0,65а

0,63а

0,65а

dctA

0,39b

0,38b

0,65а

0,58а

nifA

0,29b

0,34b

0,17c

0,21c

ntrA

0,32b

0,32b

0,17c

0,20c

П р и м е ч а н и е. МВО1 и МВО2 — микровегетационные опыты (36), ВО — вегетационный опыт (см. табл. 2). Значения, отмеченные неодинаковыми буквами, достоверно различаются как по опыту, так и в разных опытах для одного и того же гена.

Можно предположить, что недостаточная активность гена dctA в МВО с сортом Du Puits была следствием ингибирующего действия ТФА на образование ДК из поступающих в клубеньки продуктов фотосинтеза (сахароза, глюкоза). В результате возникшего дефицита ДК активность специфичных регуляторов DctBD низка, и для усиления азотфиксации требуется амплификация генов, кодирующих неспецифичные регуляторы NifA и NtrA. Для сорта Зайкевича, который способен к более активному переносу ТФА в надземные органы, чем Du Puits, факторные нагрузки для dctA оказались столь же высокими, как для dctABD, а для неспецифичных регуляторов nifA и ntrA они были невелики. Можно предположить, что благодаря быстрому выносу ТФА из клубеньков, характерному для сорта Зайкевича (см. рис. 2), скорость образования в клубеньках ДК высока, что обеспечивает активную работу регуляторной системы DctBD, поэтому для повышения активности азотфиксации достаточно амплификации гена dctA.

Это предположение подтверждается характером распределения факторных нагрузок по генам транспорта ДК при испытании бактерий-реком-бинантов на сорте Du Puits в вегетационном опыте (ВО), где оно оказалось таким же, как при испытании на сорте Зайкевича в МВО (см. табл. 5). Подобное сходство может быть связано с тем, что в ВО развитие растений пространственно менее ограничено, чем в МВО, что создает возможность для более полной передачи ТФА в надземную часть и использования азота для накопления дополнительной биомассы.

Ранее ингибирующее действие ТФА на активность нитрогеназы было выявлено у ахлорофилльных мутантов гороха; у них нарушение азотфиксирующей активности клубеньков оказалось связанным не с дефицитом энергии, а с накоплением продуктов азотфиксации, которые не транспортируются в надземные органы (44). Изучение двух видов вики — посевной (Viciasativa) и мохнатой (V. villosa) с использованием изотопных (15N) методов (45) показало, что снижение активности симбиотрофного поступления азота, которое произошло у V. sativa в результате ее окультуривания и селекции, было связано с повышением чувствительности нитрогеназной системы к азотным соединениям, образующимся в клубеньках при ассимиляции фиксированного азота.

Таким образом, генетическое конструирование высокоактивных симбиотических азотфиксаторов — важный подход к созданию систем адаптивного земледелия и растениеводства, основанного на экологически безопасных и ресурсосберегающих технологиях. Однако реализация этого подхода затруднена рядом ограничений в проявлении симбиотической активности бактерий, которые определяются неспособностью растений полностью использовать поставляемый бактериями азот и низкой воспроизводимостью симбиотического фенотипа бактерий. Первый фактор связан с физиологическими ограничениями в использовании фиксированного азота растениями, для преодоления которых необходима их генетическая модификация, включая изменение баланса разных типов азотного питания.

У люцерны перестройка на симбиотрофное питание может быть достигнута повышением активности специфичных для клубеньков форм глутаминсинтетазы, глутаматсинтазы и аспартатаминотрансферазы, играющих основную роль в усвоении растениями фиксированного азота. Результаты отбора бобовых на повышение активности этих ферментов свидетельствуют, что процесс первичной ассимиляции представляется даже более существенным для определения эффективности симбиоза, чем его снабжение энергией (46), и при снижении интенсивности фотосинтеза (мутации растений, затенение) непосредственной причиной блокирования азотфиксации в клубеньках оказался не недостаток в них углеводов, а избыток транспортных форм азота, которые накапливаются в клубеньках, но не передаются в надземные органы (44). Однако четкие корреляции между активностью нитрогеназы и малатдегидрогеназы у люцерны показывают, что повышение эффективности симбиотрофного поступления азота достигается также за счет усиления потока растительных фотосинтатов в клубеньки (46).

Для преодоления ограничений в экспрессии признака «повышенная симбиотическая активность» возможны различные подходы. Например, факторный анализ результатов вегетационных опытов позволил адекватно оценить фенотипические эффекты модификаций транспорта дикарбоновых кислот, тестируемых на сильно флуктуирующем генотипическом (связанном с полиморфизмом сортов) и средовом фоне. Дополнительное повышение воспроизводимости фенотипа бактерий может быть достигнуто снижением изменчивости сортов по симбиотическим свойствам, о чем свидетельствуют результаты анализа форм люцерны и пажитника с различным уровнем полиморфизма (41).

Указанные ограничения в проявлении повышенной симбиотической азотфиксации, как и подходы для их преодоления, необходимо также учитывать при работе с ризосферными азотфиксаторами (Azospirillum, Enterobacter, Flavobacterium). Мы показали (6), что сорта ячменя и пшеницы варьируют по соотношению симбиотрофного и автотрофного типов азотного питания, а следовательно, необходима генетико-селекционная работа по улучшению способности злаковых культур использовать биологический азот. Проведенный во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии анализ состава корневых экссудатов растений (47) указывает на необходимость отбора на увеличение количества выделяемых корнями органических кислот, которые служат оптимальными источниками питания не только для симбиотических (ризобии), но и для ризосферных (азоспириллы) азотфиксаторов.

Итак, конструирование высокоактивных штаммов бактерий-азот-фиксаторов должно сочетаться с созданием сортов растений, способных максимально полно использовать биологический азот, поставляемый микросимбионтами. Активное развитие молекулярной генетики симбиоза делает возможным переход от раздельного получения активных форм бактерий и растений к оптимизации симбиотической функции как генетически целостного объекта селекции, генной инженерии и биотехнологии.


Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Д о р о с и н с к и й  Л.М. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Л., 1970.
2. Т и х о н о в и ч  И.А.,  П р о в о р о в  Н.А. Кооперация растений и микроорганизмов: новые подходы к конструированию экологически устойчивых агросистем. Усп. совр. биол., 2007, 127(4): 339-357.
3. V a n c e  C.P. Symbiotic nitrogen fixation and phosphorous acquisition. Plant nutrition in the world of declining renewable resources. Plant Physiol., 2001, 127: 390-397.
4. Т и х о н о в и ч  И.А.,  П р о в о р о в  Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная генетика агросистем будущего. СПб, 2009.
5. П р о в о р о в  Н.А. Соотношение симбиотрофного и автотрофного питания азотом у бобовых растений: генетико-селекционные аспекты. Физиология растений, 1996, 43(1): 127-135.
6. К о ж е м я к о в  А.П.,  П р о в о р о в  Н.А.,  З а в а л и н  А.А.,  Ш о т т  П.Р. Оценка взаимодействия сортов ячменя и пшеницы с ризосферными ростстимулирующими бактериями на различном азотном фоне. Агрохимия, 2004, 3: 33-40.
7. С и м а р о в   Б.В.,  А р о н ш т а м  А.А.,  Н о в и к о в а  Н.И.,  Б а ж е н о в а  О.В., Ш а р ы п о в а  Л.А.,  П р о в о р о в  Н.А. Генетические основы селекции клубеньковых бактерий. Л., 1990.
8. S h a r y p o v a  L.A.,  P r e t o r i u s - G ü t h  I.-M.,  S i m a r o v  B.V.,  P ü h l e r  A.  Genetic improvement of Rhizobium strains. In: The nitrogen fixation and its research in Chi-na /G.F. Hong (ed.). Berlin, 1992: 266-285.
9. R e n g e l  Z. Breeding for better symbiosis. Plant and Soil, 2002, 245: 147-162.
10. S e s s i t s c h  A.,  H o w i e s o n  J.G.,  P e r r e t  X.,  A n t o u n  H.,  M a r t i n e z - R o m e r o  E. Advances in Rhizobium research. Crit. Rev. Plant Sci., 2002, 21: 323-378.
11. О в ц ы н а  А.О.,  Т и х о н о в и ч  И.А. Структура, функции и возможность практического применения сигнальных молекул, инициирующих развитие бобово-ризобиального симбиоза. Эколог. генетика, 2004, 2(3): 14-24.
12. О н и щ у к  О.П.,  С и м а р о в  Б.В. Гены, контролирующие нодуляционную конкурентоспособность клубеньковых бактерий. Генетика, 1996, 32: 1157-1166.
13. F i s h e r  H.M. Genetic regulation of nitrogen fixation in rhizobia. Microbiol. Rev.,1994, 58: 352-386.
14. К а м и н с к и  П.,  Б а т у т  Ж.,  Б о и с т а р д  П. Контроль симбиотической фиксации азота ризобиями. В кн: Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями. /Под ред. Г. Спайнка, А. Кондороши, П. Хукаса. СПб, 2002: 465-492.
15. М и ш у с т и н  Е.Н.,  Ш и л ь н и к о в а  В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М., 1973.
16. R a s t o g i  V.,  L a b e s  M.,  F i n a n  T.,  W a t s o n  R. Over-expression of the dctA gene in Rhizobium meliloti: effect on transport of C4 dicarboxylates and symbiotic nitrogen fixation. Canad. J. Microbiol., 1992, 38: 555-562.
17. B o s w o r t h  A.H.,  W i l l i a m s  M.K.,  A l b r e c h t  K.A.,  K w i a t k o w s k i  R.,  B e y n o n  J.,  H a n k i n s o n  T.R.,  R o n s o n  C.W.,  C a n n o n  F.,  W a c e k  T.J.,
T r i p l e t t  E.W. Alfalfa yield response to inoculation with the recombinant strains of Rhizobium meliloti with an extra copy of dctABD and/or modified nifA expression. Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60(10): 3815-3832.
18. J o r d i n g  D.,  U h d e  C.,  S c h m i d t  R.,  P ü h l e r  A. The C4-dicarboxylate transport system of Rhizobium meliloti and its role in nitrogen fixation during symbiosis with alfalfa (Medicago sativa). Experientia, 1994, 5(10): 874-883.
19. M c C l u n g  G.Commercialization of a genetically modified symbiotic nitrogen fixer, Sinorhizobium meliloti. Mitt. Biol. Bundesanst. Land Forstwirtsch, 2000, 380: 100-106.
20. B r e w i n  N.J.,  W o o d  E.A.,  Y o u n g  J.P. Contribution of the symbiotic plasmid to the competitiveness of Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol., 1983, 129: 2973-2977.
21. T r i p l e t t  E.W.,  S a d o w s k y  M.E. Genetics of competition for nodulation of legumes. Annu. Rev. Microbiol., 1992, 46: 399-428.
22. О н и щ у к  О.П.,  С и м а р о в  Б.В. Генетическая изменчивость нодуляционной конкурентоспособности у клубеньковых бактерий и ее использование в селекции. Генетика, 1995, 31(3): 293-303.
23. H a h n  M.,  S t u d e r  D. Competitiveness of nif Bradyrhizobium japonicum mutant against the wild-type strain. FEMS Microbiol. Lett., 1986, 33: 143-148.
24. D e v i n e  T.E.,  K u y k e n d a l l  L.D. Host genetic control of symbiosis in soybean (Glycine max L.). Plant and Soil, 1996, 186: 173-187.
25. К у р ч а к  О.Н.,  П р о в о р о в  Н.А.,  С и м а р о в  Б.В. Плазмида pSym1-32 Rhizobium leguminosarum bv. viceae, контролирующаяазотфиксирующую активность, эффективность симбиоза, конкурентоспособность и кислотоустойчивость. Генетика, 2001, 37(9): 1225-1232.
26. S a n j u a n  J.,  O l i v a r e s  L. Multicopy plasmids carrying the Klebsiella pneumonia nifA gene enhance Rhizobium meliloti nodulation competitiveness in alfalfa. Mol. Plant-Microbe Interact., 1991, 4: 365-369.
27. T r i p l e t t  E.V. Construction of symbiotically effective strain of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii with increased nodulation competitiveness. Appl. Environ. Microbiol., 1990, 56: 98-103.
28. R o b l e t o  E.A.,  K m i e c e k  K.,  O p l i n g e r  E.S.,  N i e n h u i s  J.,  T r i p l e t t  E.W. Trifoliotoxin production increases nodulation competitiveness of Rhizobium etli CE3 under agricultural conditions. Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64: 2630-2633.
29. O n i s h c h u k  O.P.,  S h a r y p o v a  L.A.,  S i m a r o v  B.V. Isolation and characterization of the Rhizobium meliloti Tn5-mutants with impaired nodulation competitiveness. Plant and Soil, 1994, 197: 267-274.
30. C h i z h e v s k a y a  E.P.,  O n i s h c h u k  O.P.,  S h a r y p o v a  L.A.,  S i m a r o v  B.V. Isolation and characterization of a gene involved in control of nodulation competitiveness of Sinorhizobium meliloti strain CXM1-105. In: Biology of Plant-Microbe Interactions. /I.A. Tikhonovich, B.J.J. Lugtenberg, N.A. Provorov (eds.). St.-Petersburg, 2004: 549-553.
31. P a n k h u r s t  C.E.,  M a c d o n a l d  P.E.,  R e e v e s  J.M. Enhanced nitrogen fixation and competitiveness for nodulation of Lotus pedunculatus by a plasmid-cured derivative of Rhizobium loti. J. Gen. Microbiol., 1986, 132: 2321-2328.
32. P l a z i n s k i  J. Tn5-inherited mutant strain of Rhizobium meliloti with a highly increased ability to fix nitrogen for lucerne. Microbiol. Lett., 1981, 18: 137-142.
33. S h a r y p o v a  L.A.,  O n i s h c h u k  O.P.,  C h e s n o k o v a  O.N., 
F o m i n a - E s h e n k o  J.G.,  S i m a r o v  B.V. Isolation and characterization of Rhizobium meliloti Tn5 mutants showing enhanced symbiotic effectiveness. Microbiology, 1994, 140: 463-470.
34. S h a r y p o v a  L.A.,  S i m a r o v  B.V. Identification of genes affecting symbiotic effectiveness of Rhizobium meliloti. In: Nitrogen fixation: fundamentals and applications /I.A. Tikhonovich e.a. (eds.). Dordrecht, 1995: 371-376.
35. S h a r y p o v a  L.A.,  Y u r g e l  S.N.,  K e l l e r  M.,  S i m a r o v  B.V.,  P ü h l e r  A.,  B e c k e r  A. The eff-482 locus of Sinorhizobium meliloti CXM1-105 that influences symbiotic effectiveness consists of three genes encoding an endoglucanase, a transcriptional regulator and an adenylate cyclase. Molec. Gen. Genet., 1998, 261: 1032-1044.
36. О н и щ у к  О.П.,  В о р о б ь е в  Н.И.,  П р о в о р о в  Н.А.,  С и м а р о в  Б.В. Симбиотическая активность ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti) с генетическими модификациями системы транспорта дикарбоновых кислот. Эколог. генетика, 2009, 7(2): 3-10.
37. Ф е с е н к о  А.Н.,  О р л о в а  И.Ф.,  П р о в о р о в  Н.А.,  С и м а р о в  Б.В. Изучение симбиотических свойств клубеньковых бактерий гороха в вегетационных опытах. Докл. РАСХН, 1995, 3: 24-26.
38. К у р ч а к  О.Н.,  П р о в о р о в  Н.А. Отзывчивость вики мохнатой (Vicia villosa Roth) и вики посевной (Vicia sativa L.) на инокуляцию ризобиями и на внесение карбамида. Физиол. растений, 1995, 42(3): 484-490.
39. С а и м н а з а р о в  Ю.Б.,  Б а х р о м о в  И.У.,  П у л а т о в а  Д.З., 
П р о в о р о в  Н.А. Биохимические показатели семян маша и арахиса при взаимодействии с клубеньковыми бактериями. Физиол. биохим. культ. растений, 1997, 29(6): 450-454.
40. H e l y  F.W.Symbiotic variation in Trifoliumam biguum M. Bieb. with special reference to the nature of resistance. Austral. J. Biol. Sci., 1957, 10(1): 1-16.
41. П р о в о р о в  Н.А.,  С и м а р о в  Б.В. Генетический полиморфизм бобовых культур по способности к симбиозу с клубеньковыми бактериями. Генетика, 1992, 28(6): 5-14.
42. П р о в о р о в  Н.А.,  Т и х о н о в и ч  И.А. Эколого-генетические принципы селекции растений на повышение эффективности взаимодействия с микроорганизмами. С.-х. биол., 2003, 3: 11-25.
43. П р о в о р о в  Н.А. Эволюция микробно-растительных симбиозов: филогенетические, популяционно-генетические и селекционные аспекты. Автореф. докт. дис. СПб, 2009.
44. Т и х о н о в и ч  И.А.,  П р о в о р о в  Н.А. Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции. СПб, 1998.
45. K u r c h a k   O.P.,  G a l a n   M.S.,  O r l o v a  O.V.,  P r o v o r o v  N.A.,  S i m a r o v  B.V. A potential for symbiotic nitrogen fixation in hairy vetch (Vicia villosa Roth) as compared with common vetch (Vicia sativa L.) In: New approaches and techniques in breeding sustainable fodder crops and amenity grasses /N.A. Provorov, I.A. Tikhonovich, F. Veronesi (eds.). St.-Petersburg, 2000: 151-155.
46. B a r n e s  D.K.,  H e i c h e l  G.H.,  V a n c e  C.P.,  E l l i s  W.R. A multiple-trait breeding program for improving the symbiosis for N2 fixation between Medicago sativa L. and Rhizobium meliloti. Plant and Soil, 1984, 32: 303-314.
47. К р а в ч е н к о  Л.В.,  А з а р о в а  Т.С.,  Д о с т а н к о  О.Ю. Влияние корневых экзометаболитов пшеницы с различной плоидностью на рост Azospirillum brasilense. Микробиология, 1993, 62: 863-868.

 

ESTIMATION OF PHENOTYPIC PRESENTATIONS OF BACTERIAL GENES, CONTROLLING THE EFFICIENCY OF NITROGEN-FIXING SYMBIOSIS WITH PLANTS

O.P. Onishchuk, N.A. Provorov, N.I. Vorob’ev, B.V. Simarov

The collection of recombinant species of nodule bacterium of lucerne (Sinorhizobium meliloti) with additional copies of dicarboxylic acid transport gene (process, limiting nitrogen fixation) was used and the authors shown, that the symbiosis efficiency is limiting by the plant inability to absolute involvement of biological nitrogen in growth process and the transfer to above-ground organs nitrogen transport forms, accumulation of which in roots and nodules inhibits an energy entry in bacteroides. On the data of factor analysis of vegetative experiment results the amplification succinate permease dctA structure gene in complex with specific transcription regulator dctBD increases the symbiosis efficiency regardless of plant variety and vegetation conditions, but the amplification of nifA and ntrA genes (nonspecific regulators of dctA gene) required for the increase of N2-fixing activity only at unfavorable for it conditions.

Keywords: symbiotic nitrogen fixation, nodule bacteria, leguminous plants, genetic construction, dicarboxylic acids, factorial analysis, symbiotic efficiency, competitiveness, ecologically safe soil tillage.

ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,

196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин-8, ш. Подбельского, 3,
e-mail: provorov@newmail.ru

Поступила в редакцию
11 января 2010 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало