Сельскохозяйственная биология, 2011, № 1, с. 85-91.

УДК 632.3:[582.683.2+579.841.112]

УСТОЙЧИВОСТЬ К ВОЗБУДИТЕЛЮ СОСУДИСТОГО БАКТЕРИОЗА И ЛИСТОВОЙ ПЯТНИСТОСТИ У Brassica rapa L. И B. napus L.

А.Н. ИГНАТОВ¹, А.М. АРТЕМЬЕВА², Ю.В. ЧЕСНОКОВ², В.А. ПОЛИТЫКО³, Е.В. МАТВЕЕВА³, А.А. ОРАЕВСКИЙ⁴, Н.В. ШААД⁵

Изучали географическое и таксономическое распределение расоспецифической устойчивости к фитопатогенным ксантомонадам среди образцов Brassica rapa и B. napus. Выявлено, что устойчивые к расе 4 Xanthomonas campestris Pam. (Dow.) (Xcc) подвиды B. rapa в основном сконцентрированы в Центральной Азии и Японии. Впервые обнаружены доноры комплексной устойчивости B. rapa ко всем исследованным расам патогена и источники устойчивости к расам Xcc 1 и Xcc 3 среди образцов B. rapa и B. napus.

Ключевые слова: расоспецифическая устойчивость, модель «ген на ген», взаимоотношения растение—патоген.

Крестоцветные растения (сем. Brassicaceae) поражаются многими фитопатогенами, из которых к наиболее вредоносным относится бактерия Xanthomonas campestris Pam. (Dow.). Патоварианты X. сampestris вызывают заболевания с разными симптомами — сосудистый бактериоз (возбудитель X. campestris pv. campestris — Xcc) и листовую пятнистость (X. campestris pv. raphani— Xcr) и, в свою очередь, делятся на физиологические расы, выявляемые по реакции сортов с расоспецифическими генами устойчивости (1, 2). Несмотря на высокий уровень генетического сходства, три диплоидных вида рода Brassica (B. rapa, B. nigra и B. oleracea) различаются по типу устойчивости к бактериозам, вызываемым X. campestris. Так, у форм с геномом B этот признак определяется геном Rxa1 (ранее обозначался как Rb) (1), с геномом А — геном Rxa4, у растений с геномом C ген Rxa3 контролирует наиболее распространенную устойчивость (2). Известны также аллельные варианты трех основных локусов и другие типы устойчивости к X. campestris (3, 4). Cелекция на патогенорезистентность затруднена из-за малого числа доступных доноров, особенно среди видов B. rapa и B. napus, а существование не менее 9 рас в популяции патогена (4) осложняет интерпретацию опубликованных к настоящему времени результатов оценки устойчивости у этих растений. Отметим также, что устойчивость к сосудистому бактериозу обнаружена у нескольких сортов B. rapa (5).

Для выяснения частоты встречаемости и географического распределения расоспецифической устойчивости мы проанализировали коллекцию образцов Brassica rapa и B. napus по реакции на штаммы пяти рас возбудителя сосудистого бактериоза и одной расы возбудителя листовой пятнистости.

Методика. Образцы B. rapa и B. napus были получены из коллекций Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР), Nati-onal Research Institute of Vegetables and Ornamental Plants (NIVOT, Япония) и Всероссийского научно-исследовательского и проектно-технологического института рапса (г. Липецк), а также некоторых селекционных компаний. Были изучены 134 образца восьми культурных подвидов B. rapa, представляющие географические регионы Западной Европы, России, Средней Азии, Китая, Кореи и Японии, и 10 дикорастущих популяций из России и Западной Европы (Великобритании и Германии). Часть образцов проанализировали ранее молекулярными методами для определения уровня генетического разнообразия, филогенетических взаимоотношений между подвидами и уточнения таксономического положения отдельных форм вида (6, 7). Также протестировали 56 образцов масличного рапса (B. napus var. oleifera L.), представленных сортами с регионом происхождения от Западной Европы до Японии.

Растения выращивали в вазонах диаметром 10 см в теплице при температуре 20/16 °С (день/ночь) и 16-часовом световом дне до инокуляции в стадии 3-4 настоящих листьев. Для инокуляции использовали штаммы пяти рас Xcc (2): B-32 (раса 6), Cal54-3 (раса 5), HRI1279a (раса 4), NCPPB528T (раса 3) и PHW231 (раса 1), а также штамм 5001a расы Xcr 1 (8). Бактерии хранились при -84 °С, инокулюм получали из 2-суточной культуры, растущей на модифицированной среде Кинга Б, разведением до титра 106 кл/мл. В варианте с расами Xcc на каждом растении методом прищипывания заражали 3-4 листа, в варианте с Xcr 1 растения опрыскивали бактериальной суспензией (107 кл/мл). После инокуляции растения помещали на 24 ч во влажную камеру, затем на 2 нед в теплицу при температуре 24 °С (день/ночь). При заражении растений прищипыванием результат учитывали через 2 нед по 3-балльной шкале: 0 — реакция не регистрируется либо некроз проявляется вокруг точки инокуляции (реакция сверхчувствительности — РСЧ); 1 — вокруг точки инокуляции наблюдается некроз, а также хлороз с диаметром зон до 0,5 см; 2 — развитие V-образных некрозов. При заражении растений опрыскиванием через 1 нед оценивали появление локальных некрозов (пятнистости) также по 3-балльной шкале: 0 — отсутствие реакции или РСЧ (диаметр зон некроза до 0,1 мм); 1 — некрозы занимают до 5 % площади листа, диаметр некротических пятен достигает 1-2 мм; 2 — более 10 % площади листа покрыто некрозами с диаметром более 2 мм. Всего провели три независимых испытания (по 50 растений каждого образца; устойчивые инокулировали повторно для подтверждения результата). По итогам трех испытаний образца определяли среднюю долю устойчивых растений (степень поражения — 0 или 1 балл) в процентах от общего числа. Число протестированных растений позволяло с вероятностью 99 % обнаружить в популяции устойчивые при частоте более 3 %.  

Достоверность различий между образцами по доле растений, устойчивых к отдельным расам, определяли методом дисперсионного анализа (9), взаимозависимость между реакцией образцов к разным расам патогена — методом корреляционного анализа по Пирсону (10) с помощью программы STATISTICA 6.0 (StatSoft, США).

Результаты. Было выявлено разнообразие реакции растений среди образцов, подвидов и географических групп. Для большинства образцов оценка растений была воспроизводимой по опытам. Реакция растений B. ra-pa различалась в зависимости от расы патогена, подвида и региона происхождения растения (табл. 1, 2 и 3). В среднем 47,3 % растений образца проявляли устойчивость к расе Xcr 1, 11,1 % — к расе Xcc 1, 18,7 % — к Xcc 3, 49,1 % — к Xcc 4, 17,0 % — к Xcc 5 и 2,0 % были устойчивы к расе Xcc 6. Только два образца B. rapa (розеточная капуста Ta-gu-tsai ВИР-129 и пекинская капуста Local ВИР-108 южнокитайского происхождения) оказались устойчивыми ко всем расам патогена, включая Xcc 6. Образцы B. napus показали более однородную реакцию и имели в среднем 92,7 % растений, устойчивых к расе Xcr 1, 37,2 % — к расе Xcc 1, 30,8 % — к Xcc 3, 95,5 % — к Xcc 4, 30,0 % — к Xcc 5, и ни одного растения, устойчивого к расе Xcc 6.

Наблюдалась высокая корреляция между реакцией растений на заражение расой Xcr1 и расой Xcc 4 (r = 0,96 для B. rapa и r = 0,915 для B. na-pus), а также между реакцией на расы Xcc 3 и Xcc 5 (r = 0,98 для B. rapa и r = 0,99 для B. napus). Кроме того, отмечалась статистически значимая корреляция (r = 0,53) между реакцией растений B. rapa на расы Xcc 1 и Xcc 5.

Обнаружилось достоверное различие в распределении устойчивости по подвидам B. rapa (см. табл. 2) и географическим зонам происхождения таких образцов (см. табл. 3). Наиболее устойчивыми к расам Xcc 4 и Xcr 1 были образцы B. rapa nipposinica, B. rapa dichotoma и, соответственно, образцы, происходящие из Центральной Азии и Японии. Среди этих растений также встречались образцы с устойчивостью к расам Xcc 1, Xcc 3 и Xcc 5. Несколько образцов индийской тории и среднеазиатских реп были устойчивы ко всем расам, кроме Xcc 6.

Наиболее часто устойчивость к расе Xcc 1 встречалась среди образцов B. rapa nipposinica и B. rapa pekinensis, к расам Xcc 3 и Xcc 5 — среди B. rapa dichotoma. Большинство растений подвидов campestris, narinosa, chinen-sis из России, Западной Европы, Китая, напротив, были восприимчивы к патогену.

Более 90 % сортов рапса проявили устойчивость к Xcc 4 и Xcr 1, но все растения этого вида оказались восприимчивыми к расе Xcc 6 и более восприимчивыми к расам Xcc 1, Xcc 3 и Xcc 5, чем B. rapa. Из-за широкого использования генетического материала из Западной Европы в селекции масличного рапса было нецелесообразным проводить сравнение сортов из разных географических зон. В целом образцы рапса характеризовались высокой однородностью реакции по сравнению с растениями B. rapa, и лишь два сорта (Hanna и Capricorn) демонстрировали восприимчивость ко всем штаммам патогена. Только 7 образцов B. napus, главным образом ярового рапса, показали комплексную устойчивость к расам Xcc 1, Xcc 3 и Xcc 5.

В расах Xcc 1, Xcc 3, Xcc 4, Xcc 5 и Xcc 6, использованных в настоящей работе, представлены 3 из 4 генов авирулентности, описанных при изучении взаимодействия «ген на ген» между дифференцирующими сортами и патогеном (1-3).

Сорта-дифференциаторы B. rapa Just Right F₁ и Tokyo Cross F₁, которые имеют общего предка (сортотип Shogoin oomaru), устойчивого к расе Xcc 4, показали идентичную реакцию при инокуляции большим числом изолятов Xcc, собранных в различных регионах (1, 2, 12, 13). Участие единственного доминантного гена в формировании устойчивости к расе Xcc 4 было подтверждено при оценке популяций, полученных при скрещиваниях Seven Top Green (гетерозиготное растение) x Just Right F1, Just Right F₁ x Just Right S4 (восприимчивая линия S4) и образца тории 3177 x Just Right S4. Все эти растения, очевидно, имели гомологичные гены устойчивости (14). Только недавно было установлено, что эти дифференциаторы, как и сорт Seven Top Green, видимо, несут различные аллели одного локуса устойчивости Rxa4 (3). Вопрос о гомологичности доминантных генов устойчивости к расе Хсс 4 у B. rapa и B. napus пока остается открытым.

Высокая корреляция между реакцией растений на расы Xcr1 и Xcc 4 подтверждает полученные ранее данные об идентичности расовой структуры этих двух патовариантов (8, 15), а связь между устойчивостью к расам Xcc 3 и Xcc 5, видимо, свидетельствует о присутствии гомологичого гена Rxа3 в растениях с геномом A.

Частота устойчивых к сосудистому бактериозу растений у образцов B. rapa была максимальной в центральноазиатской субпопуляции, которая рассматривается как генетически наиболее вариабельная часть генофонда этого вида (16), а также в генетически близкой ей японской субпопуляции (17). Раса Xcc 4 распространена в Японии, России, Великобритании и Португалии (1, 2); против нее оказалась высокоэффективной устойчивость, характерная для центральноазиатской и японской субпопуляций B. rapa.

Овощные культуры китайского происхождения, масличные культуры из Центральной Азии и репы (турнепсы) из Европы и России представляют генетически изолированные группы в популяции B. rapa, возникшие при селектирующем отборе в контрастных климатических и почвенных условиях (16, 18). В последних работах с использованием различных методов молекулярного анализа отмечена тенденция к объединению образцов в соответствии с географическим происхождением в европейскую, индийскую (или одну евразийскую) и восточноазиатскую группы (19, 20). Распределение устойчивости к расе Xcc 4 резко контрастирует в группах, разделенных незначительным расстоянием (Япония и Китай или Центральная Азия и Китай). Устойчивые ко всем шести расам образцы розеточной и листовой пекинской капусты из Южного Китая, скорее всего, близкородственны (6). Устойчивость к расе Xcc 4 у B. napus могла быть унаследована от B. rapa как диплоидного родителя. Неизвестно, являются ли гены устойчивости к одной и той же расе гомологичными во всех изученных образцах.

Таким образом, показано, что устойчивые к расе Xcc 4 Xanthomo-nas campestris Pam. (Dow.) подвиды Brassica rapa в основном сконцентрированы в Центральной Азии и Японии. Впервые обнаружены доноры комплексной устойчивости B. rapa ко всем исследованным расам патогена и источники устойчивости к расам Xcc 1 и Xcc 3 среди образцов B. rapaи B. napus. Выявленные впервые доноры комплексной устойчивости к нескольким расам патогена будут полезны при создании сортов и гибридов B. rapa и B. napus, устойчивых к сосудистому бактериозу и листовой пятнистости, вызываемым фитопатогенными ксантомонадами.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. И г н а т о в  А.Н.,  К у г и н у к и  Я.,  Х и д а  К. Возбудитель бактериозов капустных Xanthomonas campestris. О создании устойчивых к ксантомонадам растений семейства Brassiceae. С.-х. биол., 2002, 5: 75-84.
2. V i c e n t e  J.,  C o n w a y  S.,  R o b e r t s  J. e.a. Identification and origin of Xanthomonas campestris pv. campestris races and related pathovars. Phytopathology, 2001, 91(5): 492-499.
3. И г н а т о в  А.Н.,  М а з у р и н  Е.С.,  Д ж а л и л о в  Ф.С. Расы Xanthomonas campestris pv. campestris. Тр. науч.-практ. конф. «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы». М., 2008: 45.
4. F a r g i e r  E.,  M a n c e a u  C. Pathogenicity assays restrict the species Xanthomonas campestrisinto three pathovars and reveal nine races within X. campestris pv. campestris. Plant Pathol., 2007, 56(5): 805-818.
5. G u o  H.,  D i c k s o n  M.H.,  H u n t e r  J.E. Brassica napus sources of resistance to black rot in crucifers and inheritance of resistance. HortScience, 1991, 26: 1545-1547.
6. А р т е м ь е в а  А.М.,  Ч е с н о к о в  Ю.В.,  К л о к е  Э. Генетическое разнообразие и внутривидовые филогенетические взаимоотношения культур вида Brassica rapa L. по результатам анализа микросателлитов. Инф. вест. ВОГиС, 2008, 12(4): 608-619.
7. B o n n e m a  G.,  P i n o  d e l  C a r p i o  D.,  Z h a o  J., 
A r t e m y e v a  A.,  P a u l o  J.Genetic diversity in Brassica rapa. Proc. 16th Crucifer Genetic Workshop: Brassica 2008. Lillehammer, Norway, 2008: 22.
8. V i c e n t e  J.G.,  E v e r e t t  B.,  R o b e r t s  S.J. Identification of isolates that cause a leaf spot disease of brassicas as Xanthomonas campestris pv. raphani and pathogenic and genetic comparison with related pathovars. Phytopathology, 2006, 96: 735-745.
9. A n s c o m b e  F.J. The validity of comparative experiments. J. of the Royal Statistical Society, Ser. A (General), 1948, 111(3): 181-211.
10. Y u l e  G.U. Notes of Karl Pearson's lectures on the theory of statistics, 1884-96. Biometrika, 1938, 30(1/2 June): 198-203.
11. D u n c a n  D.B. Multiple range and multiple F tests. Biometrics, 1955, 11: 1-42.
12. I g n a t o v  A.,  K u g i n u k i  Y.,  H i d a  K. Pathotypes of Xanthomonas campestris pv. campestris in Japan. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica, 1999, 34(3): 177-181.
13. K a m o u n  S.,  K a d m a r  H.V.,  T o l a  E.,  K a d o  C. Incompatible interaction between crucifers and Xanthomonas campestris involve a vascular hypersensitive response: role of the hrpX locus. Molec. Plant Micr. Interact., 1992, 5: 2233-2236.
14. I g n a t o v  A.,  K u g i n u k i  Y.,  H i d a  K. Distribution and inheritance of race-specific resistance to Xanthomonas campestris pv. campestris in Brassica rapa and B. napus. J. Russian Soc. Plant Pathologists, 2000, 1: 83-87.
15. I g n a t o v  A.,  H i d a  K.,  K u g i n u k i  Y. Race-specific resistance in brassicas to black rot and leaf spot caused by Xanthomonas campestris. Beitrage zur Zuchtungsforschung, 1999, 5(1): 37-39.
16. M c G r a t h  J.M.,  Q u i r o s  C.F. Genetic diversity at isozyme and RFLP loci in Brassica campestris as related to crop type and geographical origin. Theor. Appl. Genet., 1992, 83: 783-790.
17. С и н с к а я  Е.Н. Масличные и корнеплоды семейства Cruciferae. Тр. по прикл. бот., ген. и сел., 1928, 19(3): 1-648.
18. S o n g  K.M.,  O s b o r n  T.C.,  W i l l i a m s  P.H. Brassica taxonomy based on nuclear restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). 3. Genome relationships in Brassica and related genera and the origin of B. oleracea and B. rapa syn. сampestris. Theor. Appl. Genet., 1990, 79(4): 497-506.
19. Z h a o  J.,  W a n g  X.,  D e n g  B.,  L o u  P.,  W u  J.,  S u n  R.,  X u  Z.,  V r o m a n s  J.,  K o o r n n e e f  M.,  B o n n e m a  G. Genetic relationships within Brassica rapa inferred from AFLP fingerprints. Theor. Appl. Genet., 2005, 110(7): 1301-1314.
20. W a r w i c k  S.I.,  J a m e s  T.,  F a l k  K.C. AFLP-based molecular characterization of Brassica rapa and diversity in Canadian spring turnip rape cultivars. Plant Genetic Resources: Characterization and Utilization, 2007, 6(1): 11-21.

RESISTANCE OF Brassica rapa L. AND B. napus L. TO BLACK ROT AND LEAF SPOT PATHOGENS

A.N. Ignatov¹, A.M. Artemyeva², Yu.V. Chesnokov², V.A. Polityko³, E.V. Matveeva³, A.A. Oraevskiy⁴, N.W. Schaad⁵

The authors estimated the apple varieties and hybrid gene pool created during 1970-2009 years in All-Russian Scientific Research Institute of Orchard Culture the content of sugars, organic acids, ascorbic acid and P-active substances. The peculiarities of varying and inheriting of these substances have been investigated. The prospect of apple varieties selection with improved biochemical composition of fruit was shown.

Keywords: race-specific resistance, model «gene-for-gene», interaction plant—pathogen.

Оформление электронного оттиска