УДК 577.112.7:57.088

ЦЕНТРОМЕРНЫЕ БЕЛКИ ХРОМОСОМ У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ. СООБЩЕНИЕ II. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МЕЖБЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ У РАСТЕНИЙ (обзор иностранной литературы)

Л.П. ВЛАСЕНКО1, Ю.В. ЧЕСНОКОВ2

В обзоре рассматриваются биохимические методы, широко используемые в настоящее время для поиска и подтверждения взаимодействий между белками растений: связывание белков in vitro, BN-PAGE, совместная иммунопреципитация. Приводятся примеры применения рассматриваемых методов, обсуждаются достоинства и недостатки каждого из них.

Ключевые слова: межбелковые взаимодействия, растения, метод связывания белков in vitro, BN-PAGE, совместная иммунопреципитация.

 

К настоящему времени завершены или близки к завершению несколько проектов по секвенированию генома растений. Логическим продолжением этого направления служит изучение генных продуктов — белков. Транскриптомика и протеомика быстро развиваются, естественным образом направляя внимание ученых на взаимосвязи между белками, поскольку многие белки, если не их большинство, выполняют свои функции, находясь в комплексе с другими белками. Можно говорить о своеобразном «молекулярном столпотворении» в клетке, так как 20-30 % внутриклеточного объема занято макромолекулами, недоступными для взаимодействия с другими молекулами (1). Исследования межбелковых взаимодействий становятся более интенсивными, а это значит, что экспериментальными объектами неизбежно окажутся целые сети взаимодействующих белков. Однако уже сегодня ведутся работы по изучению специфичных белок-белковых взаимодействий, позволяющие решать вопросы генной регуляции на молекулярном и эпигенетическом уровнях.

Проиллюстрируем это на примере аврор растений — белков семейства киназ, регулирующих клеточное деление. Несколько лет назад авроры были известны лишь у животных и дрожжей. Исследования аврор в растениях были начаты с поиска в базах данных ортологов аврор животных и дрожжей у модельного объекта Arabidopsis thaliana (сем. Капустные), а также у нескольких других видов растений, в том числе культурных, принадлежащих к разным семействам. Всего в арабидопсисе было выявлено три типа аврор. Присоединение к аврорам пептида GFP (англ. green fluores-cent protein) позволило установить, что авроры арабидопсиса связаны с высокодинамичными митотическими структурами — центромерами и микротрубочками веретена деления. На основании этих данных, а также имеющихся сведений по аврорам животных и дрожжей предположили, что авроры фосфорилируют серин-10 и серин-28 гистона Н3. Для каждого вида аврор проведены киназные исследования in vitro (2, 3). Результаты, полученные на арабидопсисе и других растениях, позволяют сделать вывод, что авроры в растениях существенно отличаются от аврор, присутствующих в других эукариотах, и что расхождение аврор на разные типы произошло после эволюционной дивергенции между животными и растениями. Авроры животных и растений, по-видимому, имеют единого предшественника, обнаруженного у одноклеточных организмов, например у дрожжей (2). Однако до сих пор непонятно, фосфорилируют ли авроры в растениях центромерный вариант гистона Н3, как это было показано в случае других эукариотов (4), и с какими другими партнерами они взаимодействуют для выполнения своих функций. Проводился поиск взаимодействующих партнеров авроры 1 в арабидопсисе с помощью дрожжевого двухгибридного анализа, а также аффинной хроматографии (см. ниже) (5). В общей сложности было выявлено несколько десятков белков (некоторые исследованы дополнительно), при этом два полученных набора перекрываются только по тубулиновым белкам, а среди обнаруженных белков отсутствуют как обычный, так и центромерный гистоны Н3, что предоставляет возможность дальнейших поисков взаимодействующих партнеров.

Белковые взаимодействия различаются по многим характеристикам: химической природе взаимодействия, его устойчивости и временным параметрам, биохимическому и цитологическому смыслу взаимодействий (киназная реакция в сигнальном каскаде, защита одного белка другим от окружающего воздействия, постройка молекулярных структур, например цитоскелета), содержанию исследуемых белков в клетке и др. Этим предопределяются разные подходы к поиску межбелковых взаимодействий — молекулярные, цитологические (6, 7) и биохимические. Настоящий обзор посвящен трем наиболее популярным в настоящее время биохимическим методам и опыту их применения в поисках взаимодействий белков растений.

С в я з ы в а н и е  б е л к о в  i n  v i t r o. Этот метод заключается в получении рекомбинантного целевого белка с полипептидом для аффинной хроматографии, связывании этого белка на соответствующей смоле и инкубации такой смолы в физиологических жидкостях, экстрактах, лизатах органелл или растворах предполагаемых рекомбинантных партнеров. Сообщалось об успешной очистке белковых комплексов из эукариотических клеток аффинной хроматографией — как единой процедурой, так и двумя последовательными с использованием двух разных аффинных полипептидов. В первом варианте обнаруживается большее количество неспецифически связавшихся белков, тогда как двухэтапная очистка, будучи более жесткой, может привести к потере слабых взаимодействий. В среднем при одноэтапной очистке комплексов выход белков в 3-5 раз выше, чем при двухэтапной. Полипептид для аффинной хроматографии оказывает влияние на функции белка лишь в 10-15 % случаев (8).

Ключевой вопрос для исследований взаимодействий белков in vitro — получение рекомбинантного белка для «наживки». К настоящему времени накоплен определенный опыт его производства, обобщенный S. Graslund с соавт. (9). Например, для встраивания нужного гена в вектор для экспрессии удобнее использовать клонирование, основанное на рекомбинации, и так называемое не зависящее от лигирования (LIC, англ. ligation-independent cloning), нежели подходы, основанные на использовании рестриктаз. Для рутинного производства белков широко применяют экспрессию с помощью Т7 РНК-полимеразы и N-терминальный шестигистидиновый полипептид (His6) в качестве аффинного ярлыка. Одно из преимуществ системы экспрессии Т7 в том, что при понижении температуры инкубации с 37 до 15-25 °C удается получить в растворимой форме многие белки, которые при первоначальных условиях обнаруживались в нерастворимой фракции. Культуры клеток Escherichiacoli благодаря своей дешевизне и удобству в использовании рассматриваются в качестве продуцента в первую очередь. Культура BL21 (DE3) и ее производные соответствуют такой задаче. Однако только 10 % эукариотических белков можно получить в E. сoliв растворимой форме. Более того, даже после интенсивных поисков оптимальных условий не удается выделить в растворимом виде 30 % белков самих клеток E. сoli, если проводится гиперэкспрессия таких белков.

Рекомбинантные белки в E. сoli часто накапливаются в гранулах, и для их растворения с целью последующей аффинной хроматографии требуется денатурация, тогда как для белковых взаимодействий необходима восстановленная структура белка. Аффинная хроматография с иммобилизованными ионами металла (IMAC, англ. immobilized metal ion affinity chromatography) открыла новые перспективы для эффективной очистки белков, несущих полигистидиновый полипептид, и восстановления их структуры на смоле. Полигистидиновый полипептид сохраняет прочные связи с иммобилизованными на смоле двухвалентными ионами металлов даже в присутствии высоких концентраций хаотропных агентов, что обеспечивает возможность восстановления структуры связанного белка простой сменой буфера; такая возможность сделала метод IMAC популярным (10-13). Кроме обычно используемого смывания полигистидиннесущих белков с помощью имидазола, в нативных условиях могут быть применены и другие способы (14). Для последующего разделения белковых комплексов методом SDS-PAGE (англ. sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gel electrophoresis, электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия) смывание их со смолы необязательно: комплексы разрушают кипячением смолы в SDS-буфере при 95 °C.

Хотя IMAC очень популярен как прием очистки рекомбинантных белков из культур клеток E. coli (2, 9, 15, 16), его пока еще редко используют в исследованиях с растительными экстрактами (17). Один из главных недостатков этого метода аффинной хроматографии — несовместимость с антиоксидантами и хелаторами. Хелаторы, например EDTA, применяют для ингибирования металлопротеиназ, и их можно исключить из буферов, тогда как антиоксиданты, например 2-меркаптоэтанол, совершенно необходимы при получении экстрактов из большинства видов растений и используются для предотвращения быстрого разрушения белков. Выход заключается в применении низких концентраций EDTA и 2-меркаптоэтанола на начальной стадии приготовления экстракта с последующим разбавлением образцов буфером, совместимым с IMAC (18).

К настоящему времени разработан широкий круг полипептидов и белков, присоединяемых к целевому белку для его аффинной очистки. По сравнению с описанной выше системой очистки IMAC некоторые другие системы обеспечивают более высокую степень очистки, однако обычно пригодны только для растворимого белка, который зачастую составляет лишь незначительную часть от общего количества рекомбинантного протеина. Проводилось сравнение разных систем аффинной очистки для растворимых белков из экстрактов E. coli, дрожжей, дрозофилы и клеток человека HeLa. Было показано, что белковые и пептидные ярлыки His6, CBP, CYD, Strep II, FLAG, HPC, GST и MBP значительно различаются по показателям выхода целевого белка, его чистоте и стоимости. Полипептид His6 обеспечивал хороший выход белка на недорогой смоле высокой емкости, однако чистота белка в случае E. coliбыла умеренной, дрожжей, дрозофилы и клеток HeLa — сравнительно низкой. С ярлыком CBP достигалась умеренная чистота белка в случае E. coli, дрожжей и дрозофилы и большая степень очистки — в варианте с клетками HeLa. Системы очистки, основанные на использовании антител (с ярлыками FLAG и HPC), характеризуются высшей степенью очистки всех экстрактов, однако требуют дорогой смолы низкой емкости. Был сделан вывод, что использование полипептида Strep II может оказаться оптимальным для очистки растворимого рекомбинантного белка, поскольку отличная очистка сочетается с хорошим выходом при умеренной стоимости (19).

Связыванием in vitro, как и другими описанными в настоящем обзоре методами, плохо распознаются белки, содержание которых в клетках низкое. В качестве иллюстрации можно привести пример молярных соотношений гистона CENP-A (центромерного варианта гистона Н3) и фактора, связывающего теломерные повторы, с гистоном Н4 в клетках человека — соответственно 1:70 000 и 1:100 000 (20). Поэтому важно по возможности проводить подобные исследования на фракциях органелл или в тканях, где ожидается повышенное содержание взаимодействующих партнеров.

Преимущество метода связывания белков in vitro заключается в относительной простоте биохимических манипуляций, недостаток — в необходимости предварительных молекулярно-биологических и культуральных этапов при создании рекомбинантного целевого белка (21). Связывание белков in vitro можно считать упрощенным вариантом метода, при котором производится стабильная трансформация растений или культур клеток целевым белком, несущим аффинный полипептид, с последующим выделением этого белка в составе комплекса.

B N - P A G E. BN-PAGE (англ. blue native—poliacrylamide gel electro-phoresis) — метод, основанный на разделении интактных белковых комплексов с помощью гель-электрофореза в присутствии красителя (1, 22-28). В отличие от SDS-PAGE, широко используемого для белкового электрофореза, метод BN-PAGE позволяет сохранить белковые комплексы. При этом образцы, как правило, обрабатывают мягкими неионными детергентами. В каждом конкретном случае эмпирически определяют подходящий детергент и его концентрацию, позволяющую, с одной стороны, выделить белковый комплекс из его окружения, с другой — обеспечить его стабильность. Чаще всего это дигитонин, Тритон Х-100 и додецилмальтозид (22, 23, 27). Есть сведения об использовании и других детергентов (1).

Анионный краситель Кумасси применяют в этом методе для придания отрицательного заряда белковым комплексам, что облегчает их прохождение по гелю и снижает агрегацию (неспецифическое связывание) белков. BN-PAGE чаще служит для выделения мембранных белковых комплексов, чем для растворимых. В случае белковых комплексов, находящихся в клеточных компартментах в свободном состоянии и несущих собственный отрицательный заряд, более предпочтительным может оказаться CN-PAGE (англ. colorless native- и clear native-PAGE) — модификация BN-PAGE, отличающаяся от традиционного метода BN-PAGE отсутствием красителя. CN-PAGE позволяет лучше сохранить и, соответственно, выявить слабые взаимодействия (1).

К достоинствам этого метода следует отнести невысокую стоимость материалов и отсутствие необходимости в специальном оборудовании, к недостаткам — относительно низкую разрешающую способность, вследствие чего выделение комплексов желательно проводить из фракций органелл. BN-PAGE обычно совмещают со вторичным электрофорезом (то есть используют систему двумерного электрофореза). В этом случае проводят либо повторный BN-PAGE (для повышения качества разрешения), либо (чаще) SDS-PAGE, облегчающий последующее распознавание индивидуальных компонентов белкового комплекса. Местонахождение белкового комплекса, связанного с целевым белком, может устанавливаться с помощью биохимических реакций непосредственно на геле или вестерн-блоттингом с антителами против целевого белка (21).

Среди опубликованных данных о проведении BN-PAGE отметим универсальные протоколы (22, 23), а также протокол для выявления крупных комплексов (порядка 10 MДа) c использованием для этих целей агарозного геля (24).

С о в м е с т н а я  и м м у н о п р е ц и п и т а ц и я. Метод совместной иммунопреципитации (co-IP, англ. со-immunoprecipitation) основан на инкубировании антител против целевого белка с осветленным экстрактом клеток или органелл. При этом связанный с антителом целевой белок может оказаться как в свободной форме, так и в составе белковых комплексов. Служащие «наживкой» антитела связываются с иммобилизованными на частицах носителя так называемыми белками A или G. Антитела могут быть связаны с белками A или G на смоле как до, так и после инкубации с белковым экстрактом. Так же, как в других описанных в настоящем обзоре методах, для проведения иммунопреципитации важно, чтобы использовался свежий, не подвергавшийся заморозке материал или замороженные фракции органелл, которые разрушают непосредственно перед экспериментом, иначе возможен протеолиз и агрегация белков (21).

По сравнению с описанными выше методами совместная иммунопреципитация относительно проста и позволяет с большей уверенностью утверждать, что выявленные белковые взаимодействия происходят in vivo. Недостаток метода очевиден: требуются антитела с высокой чувствительностью и специфичностью. Не все антитела, успешно используемые для вестерн-блоттинга или ELISA, подходят для иммунопреципитации; к тому же требуется большое количество антител (29). С целью снижения расходов антитела для совместной иммунопреципитации могут быть использованы многократно за счет их прочного химического связывания либо с белками A или G, либо непосредственно со смолой (30).

Для преодоления ограничений этого метода успешно использовались целевые рекомбинантные белки, несущие полипептид, для которого существуют продажные антитела, — FLAG, HA, c-myc и др. При таком подходе осуществлялась трансформация клеточной линии геном, кодирующим рекомбинантный белок, и после его трансляции в клетках и включения в белковые комплексы проводилась иммунопреципитация. У обсуждаемого приема есть дополнительное преимущество: антитело, которое связывается с целевым белком через специальный полипептид, не конкурирует с природными взаимодействующими партнерами белка за центры связывания (29).

В качестве антител могут быть использованы рекомбинантные белки. Так, недавно был разработан перспективный метод иммунопреципитации белков, несущих GFP-полипептид. Этот полипептид широко используют для цитологического изучения белков. Были получены антитела ламы против GFP, сконструирована их библиотека и для дальнейшей работы выбран один определенный фрагмент антитела. Нуклеотидную последовательность указанного фрагмента сшили с последовательностью для His6-полипептида. Показано, что такой белок (GBP, англ. GFP-binding protein) размером 13 кДа можно легко синтезировать в E. coli, очистить аффинной хроматографией и использовать для иммунопреципитации как обычные антитела. Кроме того, для более прочной связи с носителем GBP может быть ковалентно сшит с сефарозной смолой (31).

Ф и к с а ц и я  б е л к о в ы х  к о м п л е к с о в. Для стабилизации белковых комплексов применяется фиксация за счет образования ковалентных связей между компонентами комплекса и молекулами-посред-никами. Недостаток этого метода вытекает из его сути: фиксируются не только действительно взаимодействующие, но и случайные белки, поэтому для подавления фоновых связей требуются предварительные исследования по подбору оптимального фиксатора и его концентрации. Кроме того, ковалентная фиксация белков затрудняет их последующее распознавание при масс-спектрометрии. Среди веществ, используемых для связывания белков, наиболее популярен формальдегид (вследствие дешевизны и доступности в повседневной лабораторной практике) (21, 31).

Р а с п о з н а в а н и е  б е л к о в. Наиболее распространенный метод последующего анализа полученных белковых комплексов — разделение с помощью SDS-PAGE, окрашивание геля совместимыми с масс-спектрометрией красителями (азотнокислым серебром или Кумасси), вырезание из геля белковых полосок с их последующей обработкой специфическими протеазами (например, трипсином), разделением полученных пептидов с помощью жидкостной хроматографии и их масс-спектрометрическим исследованием. SDS-PAGE обеспечивает избавление от нежелательных в дальнейшем веществ (в частности, компонентов буфера) и разделяет исходную белковую смесь на более простые фракции; при этом можно также оценить количественное соотношение целевого рекомбинантного белка и его выделенных партнеров. Последующая обработка полосок геля протеазами предоставляет возможность экстрагировать полученные пептиды из геля; кроме того, для пептида количество, необходимое для прочитывания, ниже, чем для белка, и сам характер разрезания определенной протеазой может служить указанием на наличие соответствующего белка. Жидкостная хроматография, предшествующая масс-спектрометрии, значительно увеличивает количество узнанных пептидов, а объединение жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией позволяет автоматизировать процесс. Если время анализа — лимитирующий фактор в исследовании и исходная смесь белков не слишком сложная (например, в эксперименте не использовался общий клеточный лизат), то масс-спектрометрия может быть проведена без предварительной жидкостной хроматографии (8).

В настоящее время используют несколько методов масс-спектрометрии, различающихся по точности определения массы аминокислот. Дело осложняется посттрансляционными модификациями белков (например, фосфорилированием), и на выходе исследователь может получить набор нескольких альтернативных возможных последовательностей для одного пептида; большинство протеомных исследований выполняют методом LC-MS/MS (англ. liquid chromatography—tandem mass-spectrometry). Идентификация белков на основании имеющихся последовательностей пептидов проводится по базам данных, например NCBI или TIGR, при этом могут быть использованы автоматические программы, в частности MASCOT. Однако до сих пор предметом споров остается вопрос, считать ли белок идентифицированным, если ему в некоторой степени соответствуют по крайней мере два считанных пептида, или достаточно одного пептида с высокой степенью соответствия последовательности белка (8, 32, 33).

П о д т в е р ж д е н и е  б е л к о в ы х  в з а и м о д е й с т в и й. Взаимодействие белков считается более надежно установленным, если оно показано с помощью двух методов. При этом описанные выше методы могут использоваться как для первоначального поиска взаимодейству-ющих партнеров, так и для подтверждения найденного взаимодействия. Однако на практике использование дополнительного метода исследования нередко приводит к еще большей неопределенности, поскольку в этом случае два набора данных, как правило, перекрываются слабо.

Так, две научные группы независимо исследовали взаимодействия полного белкового набора дрожжей Saccharomyces cerevisiae методом дрожжевого двухгибридного анализа Y2H (англ. yeast two-hybrid) (генетический метод) (34, 35), еще две — двумя различными методами аффинной хроматографии целевых белков в составе белковых комплексов (36, 37). Результаты этих работ сопоставили между собой, а также с данными по экспрессии мРНК и описанием белков (38). Наибольшее совпадение продемонстрировали один из Y2H-анализов (35) и метод аффинной хроматографии с ТАР-концевым полипептидом (37): 21 % взаимодействий, установленных с помощью Y2H-анализа, был подтвержден данными, полученными с применением ТАР-хроматографии. В то же время до сих пор неясно, вызвано ли несоответствие между четырьмя полученными наборами данных ложноположительными или ложноотрицательными результатами. Был сделан вывод, что в целом Y2H-анализ выдает значительное число ложнопозитивных результатов и из рассмотренных методов поиска взаимодействующих партнеров наиболее надежным следует считать аффинную хроматографию с ТАР-концевым полипептидом.

Другой пример — поиск взаимодействующих партнеров авроры 1 в арабидопсисе, который выполняли с помощью дрожжевого двухгибридного анализа и аффинной хроматографии комплексов, связанных с полученной в культуре клеток арабидопсиса ТАР-меченной авророй 1 (5). В первом варианте выявили около 50 белков, во втором — в 2 раза меньше, причем перекрывание двух наборов данных было установлено только по тубулиновым белкам. Исследователи отмечают, что несогласованность результатов можно отчасти объяснить тем, что при аффинном извлечении комплексов улавливаются компоненты, не находящиеся в непосредственном контакте с целевым белком, тогда как при дрожжевом двухгибридном анализе исследуется взаимодействие белков «один на один».

Еще один пример — исследование взаимодействующих партнеров CENP-A (центромерный вариант гистона Н3) в культуре клеток человека HeLa; при этом одна группа использовала метод иммунопреципитации хроматина с иммобилизованными на носителе антителами против CENP-A, другая — с помощью аффинной хроматографии выделяла синтезированный в клетках HeLa рекомбинантный CENP-A-ТАР гистон и связанный с ним белковый комплекс. В первом варианте было обнаружено около 40 белков, во втором — около 30. При этом полученные данные перекрывались лишь по нескольким белкам, в основном по гистонам (39, 40).

По-прежнему самыми надежными при установлении факта взаимодействия белков остаются узкоспециальные методы, например энзиматическое исследование предполагаемой пары субстрат—фермент или эксперименты с потерей и восстановлением функций целевого белка. Существуют признанные алгоритмы, позволяющие отбросить некоторые артефакты. Например, обнаружение белка в нескольких исследованиях с разными «наживками» указывает, что это примесный белок. Такой же вывод может быть сделан, если обнаруженный белок принадлежит к базовому высокоэкспрессируемому белковому набору для соответствующего организма. Часто в качестве примесей выступают кератины (8).

Б а з ы  д а н н ы х. Недавно была создана программа Predicted Interactome («предсказанные взаимодействия») для арабидопсиса (41), которая позволяет прогнозировать межбелковые взаимодействия в арабидопсисе на основании известных межбелковых взаимодействий в S. cerevisiae, Caenorhabditiselegans,Drosophilamelanogaster, Homosapience и ортологии белков этих видов с белками арабидопсиса. Учитывается также коэкспрессия генов в арабидопсисе. Программа основывается на данных обычных и масштабных исследований; заявлено, что она учитывает около 20 000 взаимодействий примерно для 3600 белков арабидопсиса. Взаимодействующие партнеры, вычисленные таким способом, называются интерологами; в зависимости от имеющегося набора исходных данных рассчитывается достоверность интерологов. В некоторых случаях внутриклеточную локализацию белка можно предсказать на основании известной локализации его интерологов. Программа доступна он-лайн (http://bbc.botany.utoronto.ca/interactions/) и может быть полезна на предварительном этапе исследований.

При обсуждении полученных в исследованиях результатов очень полезна база данных Genevestigator (https://www.genevestigator.ethz.ch/gv/index.jsp), доступная он-лайн для научных учреждений. В базе имеются сведения по белкам человека, мыши, крысы, арабидопсиса и ячменя (экспрессия в разных органах и тканях, на разных стадиях развития организма, под разными воздействиями и некоторые другие сведения). Доступ к этой базе можно получить также через базу данных для арабидопсиса TAIR (раздел внешних ссылок External Link).

Широкомасштабные исследования белковых взаимодействий в растениях до сих пор не описаны. Однако имеются сведения, что для создания крупных баз данных по таким взаимодействиям ведутся работы по двум проектам (7). Также в стадии развития сейчас находится разработка карт белковых взаимодействий в растениях. Сообщается о накопленном (сравнительно небольшом) количестве исходных экспериментальных данных и перспективах разработки таких карт (42).

Итак, нами рассмотрены наиболее простые и популярные современные биохимические методы поиска взаимодействующих белков, которые применимы к белкам различных организмов, однако основное внимание мы уделили данным, полученным на растениях, поскольку протеомика растений развита в меньшей степени, чем протеомика дрожжей или животных, что отчасти объясняется большей сложностью работы с растительным материалом: прочная клеточная стенка и быстрое разрушение белков в экстрактах обусловливают дополнительные требования к условиям эксперимента. В целом исследования белковых взаимодействий в различных организмах (8) включают следующие перспективные направления: изучение временного характера белковых комплексов, динамики их образования и диссоциации, абсолютного и относительного количества белка, выделение эндогенных белковых комплексов, объединение масс-спектрометрических результатов с данными, полученными другими методами, и составление «молекулярной анатомии» клетки. Решение этих задач позволит подойти к понимаю механизмов внутриклеточных взаимодействий, включая регуляцию генной экспрессии.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. K r a u s e  F. Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes. Electrophoresis,2006, 27: 2759-2781.
2. K a w a b e  A.,  M a t s u n a g a  S.,  N a k a g a w a  K. e.a. Characterization of plant Aurora kinases during mitosis. Plant Mol. Biol.,2005, 58: 1-13.
3. D e m i d o v  D.,  V a n  D a m m e  D.,  G e e l e n  D. e.a. Identification and dynamics of two classes of aurora-like kinases in Arabidopsis and other plants. Plant Cell, 2005, 17: 836-848.
4. H o u b e n  A.,  D e m i d o v  D.,  C a p e r t a  A.D. e.a. Phosphorylation of histone H3 in plants-A dynamic affair. BBA,2007, 1769: 308-315.
5. C o u r t u e r  S. Cytosceleton-associated protein complexes during plant cell division. PhD thesis. Gent University, 2008.
6. Y o u n g  K.H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod.,1998, 58: 302-311.
7. L a l o n d e  S.,  E h r h a r d t  D.W.,  L o q u e  D. e.a. Molecular and cellular approaches for the detection of protein-protein interactions: latest techniques and current limitations. Plant J.,2008, 53: 610-635.
8. K o c h e r  T.,  S u p e r t i - F u r g a  G. Mass spectrometry-based functional proteomics: from molecular machines to protein networks. Nature Methods,2007, 4: 807-815.
9. G r a s l u n d  S.,  N o r d l u n d  P.,  W e i g e l t  J. e.a. Protein production and purification. Nature Methods, 2008, 5: 135-146.
10. Z i m m e r m a n n  B.,  H e r b e r g  F.W. Interaction of 6½His-tagged protein kinase A catalytic subunit examined using Ni-NTA Magnetic Agarose Beads. Qiagen News Issue, 1998, 4: 9-10.
11. H o l z i n g e r  A.,  P h i l l i p s  K.S.,  W e a v e r  T.E. Single-step purification/solubilization of recombinant proteins: Application to surfactant protein B. Biotechniques,1996, 20: 804.
12. H o l z i n g e r  A.,  P h i l l i p s  K.C.,  W e a v e r  T.E. Single-step purification/solubilization of 6½His-tagged proteins on Ni-NTA Agarose. Qiagen News Issue, 1996, 4: 14-15.
13. L i  M.,  S u  Z.G.,  J a n s o n  J.C. In vitro protein refolding by chromatographic procedures. Protein Exp. Purif.,2004, 33: 1-10.
14. H a n s e n  P.,  L i n d e b e r g  G. Importance of the alpha-amino group in the selective purification of synthetic histidine peptides by immobilised metal ion affinity chromatography. J. Chromatogr. A,1995, 690: 155-159.
15. K u r i h a r a  D.,  K a w a b e  A.,  M a t s u n a g a  S. e.a. Characterization of a splicing variant of plant aurora kinase. Plant Cell Physiol.,2007, 48: 369-374.
16. K u r i h a r a  D.,  M a t s u n a g a  S.,  K a w a b e  A. e.a. Aurora kinase is required for chromosome segregation in tobacco BY-2 cells. Plant J.,2006, 48: 572-580.
17. T e r p e  K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, 60: 523-533.
18. W i t t e  C.P.,  N o e l  L.D.,  G i e l b e r t  J. e.a. Rapid one-step protein purification from plant material using the eight-amino acid StrepII epitope. Plant Mol. Biol.,2004, 55: 135-147.
19. L i c h t y  J.J.,  M a l e c k i  J.L.,  A g n e w  H.D. e.a. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Exp. Purif., 2005, 41: 98-105.
20. U c h i y a m a  S.,  K o b a y a s h i  S.,  T a k a t a  H. e.a. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem.,2005, 280: 16994-17004.
21. M i e r n y k  J.A.,  T h e l e n  J.J. Biochemical approaches for discovering protein-protein interactions. Plant J.,2008, 53: 597-609.
22. S w a m y  M.,  S i e g e r s  G.M.,  M i n g u e t  S. e.a. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes. Sci. STKE,2006.
23. H e i n e m e y e r  J.,  L e w e j o h a n n  D.,  B r a u n  H.P. Blue-native gel electrophoresis for the characterization of protein complexes in plants. Methods Mol. Biol.,2007, 355: 343-352.
24. H e n d e r s o n  N.S.,  N i j t m a n s  L.G.,  L i n d s a y  J.G. e.a. Separation of intact pyruvate dehydrogenase complex using blue native agarose gel electrophoresis. Electrophoresis,2000, 21: 2925-2931.
25. W a n g  Z.J.,  X u  X.P.,  F a n  K.Q. e.a. Sample preparation for two-dimensional blue native/SDS polyacrylamide gel electrophoresis in the identification of Streptomyces coelicolor cytoplasmic protein complexes. J. Biochem. Biophys. Methods,2007, 70: 565-572.
26. S i n g h  R.,  C h e n i e r  D.,  B e r i a u l t  R. e.a. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis and the monitoring of malate- and oxaloacetate-producing enzymes. J. Biochem. Biophys. Methods,2005, 64: 189-199.
27. E u b e l  H.,  B r a u n  H.P.,  M i l l a r  A.H. Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions. Plant Methods,2005, 1: 11.
28. S u n d e r h a u s  S.,  E u b e l  H.,  B r a u n  H.P. Two-dimensional blue native/blue native polyacrylamide gel electrophoresis for the characterization of mitochondrial protein complexes and supercomplexes. Methods Mol. Biol.,2007, 372: 315-324.
29. M o n t i  M.,  O r r u  S.,  P a g n o z z i  D. e.a. Interaction proteomics. Biosci. Rep.,2005, 25: 45-56.
30. R e n  L.,  E m e r y  D.,  K a b o o r d  B. e.a. Improved immunomatrix methods to detect protein:protein interactions. J. Biochem. Biophys. Methods,2003, 57: 143-157.
31. R o t h b a u e r  U.,  Z o l g h a d r  K.,  M u y l d e r m a n s  S. e.a. A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins. Mol. Cell Proteomics,2008, 7: 282-289.
32. W i t z e l  K.,  S u r a b h i  G.K.,  J y o t h s n a k u m a r i  G. e.a. Quantitative proteome analysis of barley seeds using ruthenium(II)-tris-(bathophenanthroline-disulphonate) staining. J. Proteome Res.,2007, 6: 1325-1333.
33. B r u m b a r o v a  T.,  M a t r o s  A.,  M o c k  H.P. e.a. A proteomic study showing differential regulation of stress, redox regulation and peroxidase proteins by iron supply and the transcription factor FER. Plant J.,2008, 54: 321-334.
34. I t o  T.,  C h i b a  T.,  O z a w a  R. e.a. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. PNAS USA, 2001, 98: 4569-4574.
35. U e t z  P.,  G i o t  L.,  C a g n e y  G. e.a. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature,2000, 403: 623-627.
36. H o  Y.,  G r u h l e r  A.,  H e i l b u t  A. e.a. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature,2002, 415: 180-183.
37. G a v i n  A.C.,  B o s c h e  M.,  K r a u s e  R. e.a. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature,2002, 415: 141-147.
38. C o r n e l l  M.,  P a t o n  N.W.,  O l i v e r  S.G. A critical and integrated view of the yeast interactome. Compar. Functional Genomics,2004, 5: 382-402.
39. O b u s e  C.,  Y a n g  H.,  N o z a k i  N. e.a. Proteomics analysis of the centromere complex from HeLa interphase cells: UV-damaged DNA binding protein 1 (DDB-1) is a component of the CEN-complex, while BMI-1 is transiently co-localized with the centromeric region in interphase. Genes to Cells, 2004, 9: 105-120.
40. F o l t z  D.R.,  J a n s e n  L.E.,  B l a c k  B.E. e.a. The human CENP-A centromeric nucleosome-associated complex. Nat. Cell Biol.,2006, 8: 458-469.
41. G e i s l e r - L e e  J.,  O ' T o o l e  N.,  A m m a r  R. e.a. A predicted interactome for Arabidopsis. Plant Physiol.,2007, 145: 317-329.
42. U h r i g  J.F. Protein interaction networks in plants. Planta,2006, 224: 771-781.

 

CHROMOSOMAL CENTROMERIC PROTEINS IN HIGHER PLANTS. II. BIOCHEMICAL METHODS OF INVESTIGATION OF PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS IN PLANTS (review)

L.P. Vlasenko1, Yu.V. Chesnokov2

The review is dedicated to current popular biochemical approaches for investigation of protein-protein interactions in plants: in vitro binding assay, BN-PAGE, co-immunoprecipitation. The examples of practical using of concerned methods are given, merits and demerits of each method are discussed.

Key words: protein-protein interaction, plant, in vitro binding assay, BN-PAGE, co-immunoprecipitation.

1Институт Лейбница генетики растений
и исследования возделываемых культур,
Гатерслебен, D-06466,Германия;
2ГНУ ГНЦ РФ Всероссийский НИИ
растениеводства им. Н.И. Вавилова,
190000 г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44,
e-mail: yu.chesnokov@vir.nw.ru

Поступила в редакцию
13 августа 2008 года

 

Оформление электронного оттиска

назад в начало