Сельскохозяйственная биология, 2009, № 1, с. 3-15.

УДК 633.111:581.19:575:577.2:631.527

ПУРОИНДОЛИНЫ В СВЯЗИ С ПЕРСПЕКТИВАМИ СЕЛЕКЦИИ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ НА КАЧЕСТВО И УСТОЙЧИВОСТЬ (обзор иностранной литературы)

А.Г. ХАКИМОВА, О.П. МИТРОФАНОВА

Обсуждаются результаты молекулярно-генетического изучения текстуры эндосперма зерновки у мягкой пшеницы. Рассматриваются биохимические характеристики пуроиндолинов — одного из главных семейств липопротеидов, определяющих различия текстуры эндосперма, генетический контроль этих белков и географическое распространение аллелей генов. Обсуждаются перспективы использования генетического разнообразия пуроиндолинов в селекции на улучшение мукомольных, хлебопекарных и кондитерских свойств зерна, качества кормов и повышение устойчивости растений к патогенам.

Ключевые слова: мягкая пшеница, пуроиндолины, твердозерность/ мягкозерность, качество зерна.

Прорыв в познании молекулярно-генетических основ клейковинного комплекса белков зерна пшеницы, в том числе в определении роли пуроиндолинов, влияющих на формирование текстуры эндосперма, позволяет обозначить перспективы селекции с использованием генетического разнообразия аллелей генов, контролирующих пуроиндолины.

Текстура зрелого эндосперма, представляющая собой один из важнейших показателей качества зерна у мягкой пшеницы, обусловлена сцеплением белков матрикса эндосперма с крахмальными зернами. По сравнению с зерновками, имеющими мягкий эндосперм, у сортов с твердым помол зерна — продолжительная и энергоемкая процедура. При этом получается мука с более крупными частицами (выход также зависит от текстуры зерновки), содержащая большое число поврежденных крахмальных зерен, с чем связана ее высокая водопоглотительная способность. Из-за доступности большего количества углеводов в качестве субстрата для дрожжей мука из зерна сортов мягкой пшеницы с твердым эндоспермом предпочтительна для выпечки дрожжевого хлеба, с мягким — бездрожжевого и кондитерских изделий (сухого печенья, кексов, тортов и др.) (1). Товарные классификации зерна в некоторых странах основаны на особенностях текстуры эндосперма; в России этот показатель не учитывается.

Из известных методов измерения твердости зерна широко используются два — определение индекса размера частиц (particle size index, PSI) по доле выхода муки, просеянной через сита определенного размера (2, 3), и применение инфракрасной спектроскопии в ближнем диапазоне излучений (near infrared spectroscopy, NIRS) (3, 4). Типичные значения PSI для муки, размолотой на мельнице UD-cyclone (Швеция), варьируют в пределах 60-70 для мягкозерной и 45-60 для твердозерной пшеницы.

С помощью NIRS (5) параметры качества определяли на суммарных навесках цельно смолотого зерна, а с конца 1990-х годов несколько компаний предложили поставлять автоматизированные системы, позволяющие определять содержание белка, твердость зерна и другие показатели на единичных зерновках. Наиболее широко используется Single Kernel Characterization System 4100 (SKCS) (Perten Instruments North America Inc., США) (3, 6). Для стандартизации приборов и измерения твердости эндосперма применяются эталонные образцы зерна генетически чистых мягкозерных и твердозерных сортов мягкой пшеницы (7). Эталонный набор включал следующие сорта: твердозерные — TAM 105, Arapahoe, Newton, Yecorn Rojo, Lan, мягкозерные — Cardinal, Titan, Madsen, Malcolm, Tes. При анализе на SKCS у сортов из первой группы значения твердости составили 60-80, второй — 20-40 ед.

Первые генетические исследования характера наследования текстуры зрелого эндосперма были выполнены на гибридах от скрещивания твердозерной мягкой пшеницы сорта Falcon с мягкозерной сорта Heron (8) и показали, что различия сортов по этому признаку контролируются одним геном. В этой же работе при анализе F₁ гибридных популяций от семи других скрещиваний между твердозерной и мягкозерной пшеницей наряду  с основным были выявлены минорные гены, влияющие на степень проявления признака. Ген, контролирующий твердый эндосперм, локализовали в коротком плече хромосомы 5D и обозначили Ha (Hardness) (хотя доминантным признаком фактически была мягкая текстура эндосперма) (9, 10).

Б и о х и м и ч е с к а я   х а р а к т е р и с т и к а   и   л о к а л и з а ц и я   п у р о и н д о л и н о в. Более глубокое понимание свойств текстуры эндосперма пришло в результате обнаружения белка, названного friabilin (11) с молекулярной массой 15 кДа, который присутствует в отмытом водой крахмале на поверхности крахмальных зерен, причем в большом количестве у мягкозерных сортов мягкой пшеницы, в незначительном — у твердозерных и не выявляется у тетраплоидной пшеницы Triticumdurum Desf. Описаный белок стали рассматривать в качестве маркера мягкозерности. Оказалось, что его накопление в семенах пшеницы, как и признак твердозерности, контролируется коротким плечом хромосомы 5D (12), на основании чего предположили, что friabilin — продукт гена Ha. В подтверждение гипотезы было показано, что содержание белка friabilin и степень мягкости эндосперма зависят от дозы доминантных аллелей гена Ha: гомозигота HaHaHa характеризуется большим количеством этого белка и мягкой текстурой зерна, hahaha — незначительным количеством и твердым эндоспермом; промежуточные значения обоих показателей наблюдали у гетерозигот HaHaha и Hahaha (13).

Биохимические исследования установили, что friabilin состоит из пуроиндолинов (puroindolines) и семейства белков мягкозерности (grain softness protein family, GSP-1) (12, 14-16). Пуроиндолины как поверхностно активные белки взаимодействуют с липидами мембран крахмальных зерен, образуя своеобразную прослойку между ними и белковым матриксом зерна, и тем самым предохраняют крахмальные зерна от разрушения при размоле.

Впервые сильно основной амфифильный белок (pI = 11), богатый остатками цистина и триптофана и названный пуроиндолином, выделили в начале 1990-х годов из эндосперма мягкой пшеницы французского сорта Camp Remy с использованием неионного детергента Тритона X-114 (17). При разделении SDS-электрофорезом выявлены две изоформы белка с очень близкой электрофоретической подвижностью — пуроиндолин a (PINA) и пуроиндолин b (PINB). Полипептидная цепь PINA содержала 115 аминокислотных остатков и формировала пять равномерно расположенных дисульфидных мостиков; особенность полипептида — присутствие уникального богатого триптофаном домена (БТД) в положении с 38-го по 45-й аминокислотный остаток: Trp—Arg—Trp—Trp—Lys—Trp—Trp—Lys. Аналогичный домен PINB включал Trp—Pro—Trp—Trp—Trp—Lys (14). В целом между PINA и PINB обнаружено около 60 % гомологии. Гены, кодирующие каждый из этих белков, оказались полностью сцепленными между собой и с Ha локусом в хромосоме 5DS.

В зерновке пшеницы содержание пуроиндолинов составляет 0,07-0,10 % от сухого вещества (18). Эти белки относят к классу альбуминов, однако они легко растворяются в воде только после высвобождения из прочного липидно-белкового комплекса мембран крахмальных зерен (18). Продемонстрировано, что PINA и PINB по-разному взаимодействовали с фосфо- и гликолипидами эндосперма. Их комплекс с полярными липидами мембран стабилизируют ионные, водородные и гидрофобные связи, причем БТД важен для этого взаимодействия.

Белки GSP-1 отвечают за 5 % уровень различий твердости эндосперма (19). По первичной структуре GSP-1 подобны пуроиндолинам, но у них большая часть остатков триптофана заменена на фенилаланин. Гены, контролирующие GSP-1, локализованы в каждой из трех хромосом 5-й гомеологичной группы, в хромосоме 5D один из генов сцеплен с генами пуроиндолинов (20).

Пуроиндолины синтезируются в форме предшественника и превращаются в зрелые белки посредством сайт-специфического ограниченного протеолиза (14). С использованием моноклональных антител к PINA и PINB выявлена локализация этих белков (21, 22): PINA расположен в эндосперме и взаимодействует с белковым матриксом и крахмальными гранулами, PINB — в мелких включениях в алейроновом слое и эндосперме. Поскольку пуроиндолины не обнаруживали в листьях и корнях растений, пришли к выводу, что это специфические запасные белки зерна (14, 23). Их иРНК накапливалась через 8-12 сут после опыления, ее количество достигало максимума на 26-36-е сут, затем быстро снижалось. Зрелые синтезированные белки, возможно, хранятся в белковых телах (21).

Р а з н о о б р а з и е   с п о н т а н н ы х   м у т а ц и й   г е н о в   п у р о и н д о л и н о в. В настоящее время у мягкой пшеницы выявлено 5 мутантных аллелей гена, контролирующего PINA, и 13 аллелей гена, отвечающего за PINB.

Первая из идентифицированных спонтанных мутаций, связанных с твердой текстурой эндосперма (аллель Pinb-D1b), изменяла аминокислотную последовательность PINB (24) (замена гуанина на аденин в первой позиции триплетного кодона для глицина, что приводило к замещению этого аминокислотного остатка серином в позиции 46). Вторая (Pinа-D1b), также контролирующая проявление этого признака, изменяла PINA: мутация оказалась нуль-аллелем, при наличии которого не обнаруживался ни белок, ни его иРНК (25). Затем были найдены другие мутации, влияющие на синтез пуроиндолинов и текстуру эндосперма (табл. 1).

В большинстве случаев эти мутации представляли собой либо замену, вставку или выпадение единичного нуклеотида, что обусловливало замену какой-либо аминокислоты в белковой молекуле или прекращение синтеза белка вследствие появления бессмысленного кодона (nonsense codon), либо замену целого ряда аминокислотных остатков и прекращение синтеза полипептида за счет сдвига рамки считывания с образованием такого кодона. Следует отметить, что все выявленные мутации затрагивали или доменный участок полипептидной цепи пуроиндолинов, или участки, расположенные близко к нему. Только в одном случае у замещенной линии Chinese Spring/Red Egyptian 5D была обнаружена делеция, сопровождающаяся элиминацией сразу трех генов — Pina, Pinb и GSP-D1 (19). Для идентификации такого рода наследственного изменения аллели генов обозначили как Pina-D1k, Pinb-D1q и GSP-D1i (28). Текстура эндосперма зерновки указанной замещенной линии характеризовалась очень высокой степенью твердости, соизмеримой с показателем зерна тетраплоидной твердой пшеницы. Новые мутации генов пуроиндолинов ежегодно систематизируются и уточняются в Приложениях к каталогу генных символов пшеницы (28, 29).

Р а с п р о с т р а н е н и е   м у т а н т н ы х   а л л е л е й   г е н о в   Pina и   Pinb у   м я г к о й   п ш е н и ц ы   р а з л и ч н о г о   г е о г р а ф и ч е с к о г о   п р о и с х о ж д е н и я. Для изучения распределения мутаций генов пуроиндолинов среди яровой и озимой мягкой пшеницы разного географического происхождения использовали геномную ДНК, выделенную из листьев проростков, и специфические праймеры, которые в полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировали фрагменты ДНК, соответствующие полной последовательности генов пуроиндолинов или ее части (14, 24, 26). Электрофоретический анализ продуктов амплификации, их секвенирование и сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями известных аллелей позволили судить о сходстве и различии мутаций. Молекулярные исследования обычно дополнялись оценкой репрезентативных выборок зерновок по твердости и SDS-электрофорезом пуроиндолинов в полиакриламидном геле (табл. 2). Для сравнения выборок мягкозерных и твердозерных образцов различного происхождения нами рассчитана частота встречаемости (%) аллелей на основании приведенных данных. Отметим, что в каждой из исследованных выборок были выявлены также гетерогенные образцы, представленные смесью мягкозерных и твердозерных биотипов, которые при расчетах не учитывали.

Выборки сортов мягкой пшеницы из Северной Европы, Северной Америки и Южной Австралии включали больше твердозерных образцов, чем выборка сортов из Китая. В ней мягкозерные образцы преобладали не только среди местных и старых селекционных сортов, но также среди современных селекционных. По мнению F. Chen с соавт. (32), высокая частота встречаемости мягкозерной пшеницы китайского происхождения — во-первых, результат использования зерна в основном для приготовления парового хлеба и лапши, во-вторых, того, что селекция на улучшение хлебопекарного качества до 1990-х годов не велась. Китайская мягкая пшеница характеризовалась также тем, что, кроме часто встречающихся во всех выборках мутантных аллелей Pina-D1b и Pinb-D1b, у значительной части сортов присутствовал аллель Pinb-D1p, который в других выборках не обнаружен, а также три редких аллеля — Pina-D1m, Pinb-D1d и Pinb-D1t. Таким образом, рецессивные мутации обоих пуроиндолиновых генов, определяющих твердость эндосперма, случайно или по каким-либо причинам сохранились в генофонде китайской мягкой пшеницы. Представляет интерес факт достаточно высокой частоты мутантного аллеля Pinb-D1c у североевропейских сортов, в то время как в других выборках он или не выявляется, или встречается с низкой частотой.

Изучение исторически важных линий хлебной пшеницы, полученных в Мексике, показало, что с начала селекционных программ в CIMMYT (International Maize and Wheat Improvement Center) преобладал аллель Pina-D1b: из 373 линий 328 были твердозерными, из них 283 содержали этот аллель (35), остальные несли аллель Pinb-D1b. Информация о сортах — носителях различных аллелей генов пуроиндолинов в настоящее время достаточно полно систематизирована (36, 37).

Отметим, что сведений об аллелях генов пуроиндолинов, присутствующих в российских сортах, практически нет. Известно только, что для американских твердозерных сортов Calcutta, Ruby, Red Bobs и Supreme источниками мутантного аллеля Pinb-D1c, по-видимому, были сорт Онега и сорт Ладога, представленный смесью мягкозерных и твердозерных биотипов, при этом последние имели аллель Pinb-D1c. Возможными источниками аллеля Pinb-D1b могли быть сорта Turkey и Red Five, принадлежащие крымской группе твердозерной мягкой пшеницы (33).

В коллекции пшеницы Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова имеются образцы — источники аллелей дикого типа обоих генов пуроиндолинов, а также мутантных генов Pina-D1b, Pinb-D1b, Pinb-D1c, Pinb-D1d, Pinb-D1e и Pinb-D1g (преимущественно селекционные сорта яровой и озимой мягкой пшеницы, поступившие в разное время из США и Канады).

П у р о и н д о л и н ы   р е д к и х   в и д о в   п ш е н и ц ы,   э г и л о п с а   и   д р у г и х   з л а к о в. Среди культурных растений, представляющих настоящие злаки, пуроиндолины отсутствуют у риса, сорго, кукурузы (38) и содержатся в семенах разных видов пшеницы (21), эгилопса (39), овса (40), ячменя (41), ржи и тритикале (38, 42). Они выявлены у всех диплоидных видов пшеницы, но не обнаружены у тетраплоидных (вероятно, вследствие утраты в процессе эволюции) (38). Гексаплоидные пшеницы получили функционально активные аллели, контролирующие эти белки, от Aegilopstauschii Coss. — донора генома D. Анализ 50 образцов этого вида показал, что 13 имели такие же аллели дикого типа, как и мягкозерная мягкая пшеница (43), у 14 наблюдали сходные изменения по единичному нуклеотиду в последовательности гена Pina (мутантный аллель обозначили как Pina-D1c). У ряда образцов последовательности различались по 2-3 нуклеотидам в четырех полиморфных сайтах (аллели Pina-

D1d, Pina-D1e и Pina-D1f). Изменения в нуклеотидных последовательностях гена Pinbпо сравнению с аллелями дикого типа были обнаружены в 33 сайтах. Трем уникальным мутантным аллелям присвоили символы Pinb-D1h, Pinb-D1iи Pinb-D1j. В работе M.C. Simeone с соавт. (44) приведены нуклеотидные последовательности кодирующих и некодирующих участков генов пуроиндолинов, содержащих регуляторные элементы, для 28 диплоидных видов пшеницы и эгилопса. Важно отметить, что у изученных диплоидных видов пшеницы и эгилопса Ae. tauschii, Ae. uniaristata Vis, Ae. sharonensis Eig, Ae. speltoides Tausch, Ae. bicornis (Forsk) Jaub. et Spach., Ae. caudata L., Ae. comosa Sibth. et Sm., Ae. umbellulata Zhuk. и Ae. neglecta = Ae. recta (Zhuk.) Chennav. выявлено больше мутаций генов пуроиндолинов, чем у мягкой пшеницы, однако зерновки у всех этих видов имели мягкую текстуру эндосперма, поскольку мутации не влияли на третичную структуру пуроиндолинов и не нарушали связывания этих белков с липидами мембран крахмальных зерен (45). Тетраплоидный вид Ae. ventricosa Tausch (2n = 4x = 28; геном DVDVNVNV), также мягкозерный, в отличие от других исследованных обладал активными аллелями сразу четырех генов: Pina-D1a и Pinb-D1h в хромосоме 5DV и Pina-N1a и Pinb-N1a в хромосоме 5NV (46). Первые два аллеля ранее выявили у мягкой пшеницы и Ae. tauschii, два других, локализованных в геноме N, обнаружили впервые. Белок PINA, кодируемый Pina-N1a, отличался от белка дикого типа большим числом аминокислотных замен, в то время как в PINB имелась только одна замена в области БТД — лизина на аргинин в позиции 42.

Молекулярные эволюционные изменения в локусе Ha у пшеницы, эгилопса, ржи и ячменя описаны детально (47-50).

П е р с п е к т и в ы   с е л е к ц и и   п о   и с п о л ь з о в а н и ю   р а з н о о б р а з и я   а л л е л е й   г е н о в   п у р о и н д о л и н о в. Первостепенную роль в определении качества зерна пшеницы играют запасные белки — глютенины и глиадины, образующие клейковинный комплекс, а также минорные компоненты эндосперма, в том числе пуроиндолины.

Создание сортов мягкой пшеницы с различными мукомольными, хлебопекарными и кондитерскими свойствами зерна. Как уже отмечалось, наибольшие показатели твердости зерна имеют тетраплоидные пшеницы, у которых отсутствуют гены пуроиндолинов. В пределах твердозерной и мягкозерной мягкой пшеницы выявлены существенные различия по текстуре эндосперма, благодаря чему посредством скрещивания между собой твердозерных сортов, мягкозерных сортов, а также гибридизации твердо- и мягкозерных можно улучшать текстуру эндосперма и связанные с ней признаки качества (51-53).

Оценка 40 французских мягкозерных и твердозерных сортов пшеницы, выращенных в четырех географических пунктах, по 11 признакам хлебопекарного качества показала, что различия по количеству пуроиндолинов значимо не влияли на суммарное содержание белка в зерне, но отрицательно коррелировали с объемом хлеба (54). Расчеты множественных коэффициентов корреляций, выполненные для каждого из двух классов сортов, указали на значимую роль PINB для хлебопекарных свойств муки: разное содержание этого белка у сортов с мягкой текстурой зрелого эндосперма было сопряжено с различиями по силе теста, объему и пористости хлеба.

Для получения мягкозерных сортов мягкой пшеницы необходимо присутствие обоих пуроиндолиновых белков — PINA и PINB, причем дикого типа. С использованием методов генной инженерии на твердозерных сортах мягкой пшеницы было изучено влияние присутствия дополнительных копий аллелей Pina-D1a и Pinb-D1a на текстуру эндосперма и свойства муки. У трансгенных линий, полученных на основе сорта Bobwhite (генотип Pina-D1b/Pinb-D1a), наблюдали накопление Pina-транскрипта в результате введения копий Pina-D1a (55). При этом по сравнению с нормальной мягкозерной пшеницей суммарное содержание PINA и PINB увеличивалось в 2,5 и 5,5 раза, а их количество в связанном с крахмалом комплексе friabilin — соответственно в 3,8 и 7,8 раза. У самого сорта Bobwhite связанного с крахмалом PINA не выявлено, у трансгенных линий этого белка было в 5,7-13,7 раза больше, а связанного PINB — в 0,9-2,5 раза больше, чем у контрольного мягкозерного сорта.

На серии трансгенных изолиний другого твердозерного сорта мягкой пшеницы Hi-line (генотип Pina-D1a/Pinb-D1b)изучали пригодность муки для хлебопечения и кондитерского использования (56). Трансгенные линии HGA, HGB и HGAB с дополнительными копиями аллелей дикого типа (соответственно Pina-D1a, Pinb-D1a или Pina-D1a + Pinb-D1a) различались по степени мягкости эндосперма, а также составу фракций и общему выходу муки: для HGAB и Hi-line выход муки тонкого помола составил соответственно 404 и 202 гxкг-1, общий — 711 и 744 гxкг-1. По сравнению с исходным сортом и линией HGA у линий HGAB и HGB в полученной муке содержание золы и поврежденных крахмальных зерен ниже, то есть ее предпочтительнее использовать для кондитерского производства. На гибридах, полученных от скрещивания трансгенных линий с мягкозерным сортом Heron и твердозерными сортами мягкой пшеницы, также показано, что Pinb-D1a по сравнению с Pina-D1a в большей степени увеличивает общее количество белков, связанных с крахмалом, и мягкость зерна (57, 58).

Особый интерес в качестве исходного материала для селекции мягкой пшеницы представляет описанная замещенная линия Chinese Spring/Red Egyptian 5D. С одной стороны, с ее использованием при дополнительном введении генов, определяющих желтую окраску семолины, белую — зерновки, а также низкую полифенолоксидазную активность, могут быть получены сорта мягкой пшеницы с качеством муки, приемлемым для производства макарон (19). С другой стороны, передав в генотип линии аллели генов пуроиндолинов от диплоидных доноров, удалось увеличить степень мягкости эндосперма по сравнению с мягкой пшеницей (12, 15, 45). Были получены два типа линий: у одних пара хромосом 5А мягкой пшеницы замещена на пару хромосом 5Am от культурной однозернянки T. monococcum L., у других — хромосомы 5B замещены хромосомами 5Ss от Ae. searsii Feldman and Kislev ex K. Hammer. На основе этих линий и сорта Chinese Spring, несущего аллели дикого типа генов пуроиндолинов в хромосоме 5D, были созданы новые гексаплоидные линии, содержащие четыре (состав хромосом 5Am5Am5D5D или 5Ss5Ss5D5D) и шесть (5Am5Am5Ss5Ss5D5D) копий генов этих белков. Введение каждой дополнительной копии Pina-D1a и Pinb-D1a увеличивало мягкость зерна примерно на 10 ед. при оценке на SKCS по сравнению с этим показателем для Chinese Spring. Замещенная линия с хромосомами от культурной однозернянки имела более мягкий эндосперм, чем исходный сорт.

Поскольку введение в генотип мягкой пшеницы хромосом культурной однозернянки приводило к увеличению мягкости зерна, попытались создать линии, несущие небольшой участок хромосомы 5Am, чтобы исключить нежелательные эффекты имеющихся в ней других генов в отношении хозяйственно ценных признаков (59). Отобраны генотипы, содержащие сегмент этой хромосомы размером 6,3 сМ (centimorganide) в хромосоме 5D мягкой пшеницы, который расположен проксимально по отношению к локусу Ha. Тесно сцепленные с введенным сегментом молекулярные маркеры облегчают контроль его передачи в создаваемые сорта.

Перспективный исходный материал для расширения разнообразия аллелей генов пуроиндолинов, повышающих мягкость текстуры эндосперма, создан в CIMMYT. Среди гексаплоидных линий синтетической пшеницы (2n = 6x = 42, AABBDD), полученной от скрещивания разных сортов T. durum (2n = 4x = 28, AABB) с образцами Ae. tauschii (2n = 2x = 4, DD), выявлены три линии с новыми вариантами пуроиндолинов (один — для PINA, два — для PINB), которые обусловливают формирование более мягкой текстуры зерна, чем у мягкозерной мягкой пшеницы (60). При гибридизации этих линий с мягкой пшеницей новые аллели генов пуроиндолинов легко передаются потомству (35).

Таким образом, для селекции мягкой пшеницы с различной текстурой эндосперма имеется разнообразный исходный материал. Гены пуроиндолинов от других видов функционально активны в генотипе мягкой пшеницы и могут усиливать эффект ее собственных генов. Молекулярно-генетические технологии позволяют целенаправленно формировать генотип сорта с заданными значениями твердости и мягкости эндосперма, требуемыми для хлебопекарного и кондитерского производства.

Повышение эффективности использования кормов. Крахмал — один из основных нутриентов для жвачных животных, причем от того, где он переваривается, зависит природа конечных продуктов. Так, в рубце это  летучие продукты распада жирных кислот, в тонком кишечнике — глюкоза. При ферментации крахмала в тонком кишечнике образуется на 42 % больше энергии, чем в желудке (61). Текстурой зерна злаков определяется степень и место переваривания крахмала (62). В нескольких сериях экспериментов с использованием сорта Hi-line и трансгенных линий показано, что увеличение содержания PINA и PINB приводит к уменьшению переваримости сухого вещества и крахмала в рубце соответственно на 29,2 и 30,8 % (63), причем размер частиц муки не влияет на этот процесс. Возможно, пуроиндолины защищают молекулы крахмала от действия ферментов в желудке жвачных животных, потенциально увеличивая его количество, поступающее для переваривания в тонкий кишечник. Полученные результаты указывают на перспективность применения генетической трансформации к другим зерновым культурам с целью повышения их кормовых качеств.

Защита от вредных организмов. Внимание исследователей привлекают также противомикробные и фунгицидные свойства пуроиндолинов (17, 21). В опытах in vitro показано, что PINA и PINB могут ингибировать рост штаммов бактерий, причем при совместном действии эффект возрастает (22). Структурно пуроиндолины сходны с тионинами и неспецифическими белками, переносящими липиды, которые также проявляют противомикробную активность (64). Методом трансформации гены Pina и Pinb пшеницы были введены в геном высокоурожайного, но чувствительного к болезням сорта риса М202, после чего пуроиндолиновые белки выявили не только в зерновке, но и в листьях (65). Линии М202, содержащие аллели дикого типа Pina-D1a, Pinb-D1a или Pina-D1a + PinbD1a,имели более мягкую текстуру эндосперма (66). При испытании на устойчивость к пирикуляриозу и ризоктониозу (у риса эти заболевания могут обусловливать до 50 % потерь урожая) у всех линий отмечали ее повышение на 2-40 % (в наибольшей степени — у линий, содержащих Pina-D1a или Pina-D1a + PinbD1a). В 2003 году в США выдан патент на получение трансгенных растений с аллелями генов пуроиндолинов от пшеницы (67), в котором представлены данные о наличии у трансгенных растений пуроиндолинов не только в эндосперме зерновки, но и в листьях, а также о повышении ее устойчивости к возбудителям головни. Поскольку пуроиндолины в норме присутствуют у пшеницы и хорошо перевариваются человеком и животными, их включение в трансгенные растения других культур предпочтительнее использования компонентов, которые у растений отсутствуют.

В последние годы подтверждение защитных свойств пуроиндолинов получено в опытах с искусственно синтезированными богатыми триптофаном короткими катионными пептидами, обладающими противомикробной и гемолитической активностью (68). Широко известные представители этой группы — индолицидин и триптицин, выделенные из тканей животных. Недавно синтезирован пептид puroA, состоящий из 13 аминокислотных остатков (Phe-Pro-Val-Tre-Trp-Arg-Trp-Trp-Lys-Trp-Trp-Lys-Gly-NH2), представляющих собой часть последовательности PINA пшеницы. Показано, что этот пептид увеличивает устойчивость в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (68). Другой синтетический пептид (Phe-Pro-Val-Tre-Trp-Pro-Tre-Lys-Trp-Trp-Lys-Gly-NH2) соответствовал части последовательности PINB и имел более низкую антимикробную активность, чем puroA. В модельных опытах выявлено, что пуроиндолиновые пептиды, как многие другие короткие пептиды, проникая в мембранные структуры бактерий, образуют ионные каналы, или поры, вызывают дефекты структуры либо растворяют мембраны подобно детергентам (69, 70). Короткие пептиды, обладающие антимикробной активностью, рассматривают как потенциальную альтернативу традиционным антибиотикам из-за быстрого селективного действия и высокой токсичности при низком потенциале устойчивости к ним микроорганизмов (68).

Итак, благодаря открытию пуроиндолинов, их разностороннему молекулярно-генетическому анализу достигнут значительный прогресс в изучении текстуры эндосперма зерновки у мягкой пшеницы и обозначены направления селекционного использования пуроиндолинов. Методами генной инженерии выявлен и создан уникальный исходный материал для селекции. К сожалению, в России подобного рода работы не проводятся, в том числе не раскрыт генофонд современных и старых российских селекционных сортов пшеницы, а также потенциал коллекции пшеницы Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР) по разнообразию аллелей генов пуроиндолинов, что облегчило бы создание сортов пшеницы с высоким качеством зерна.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. T i p p l e s  R.H.,  K i l b o r n  R.H.,  P r e s t o n  K.R. Bread-wheat quality defined. In: Wheat, production, properties and quality. W. Bushuk, V.F. Rasper (eds.). Glasgow, U.K., 1994: 25-35.
2. W i l l i a m s  P.C.,  S o r b e r i n g  D.C. Attempts at standardization of hardness testing of wheat. 1. The grinding/sieving (particle size index) method. Cereal Foods World, 1986, 31(359): 362-364.
3. AACC. Approved methods of the. American Association of Cereal Chemists, 10th ed. Am. Assoc. Cereal Chem., St. Paul, M.N., 2000.
4. N o r r i s  K.N.,  H r u s c h k a  W.R.,  B e a n  M.M. A definition of wheat hardness using near infrared reflectance spectroscopy. Cereal Foods World, 1989, 34: 696-705.
5. D o w e l l  F.,  M a g h i r a n g  E. Accuracy and feasibility of measuring characteristics of single kernels using near infrared spectroscopy. In: ICC Conference «Novel raw materials, technologies and products new challenge for quality control». Budapest, Hungary, 2002. (http://eru.gmprc.ksu.edu/publications/documents/iccfinal.pdf).
6. G a i n e s  C.S.,  F i n n e y   P.F.,   F l e e g e  L.M. e.a. Predicting a hardness measurement using single — kernel characterization system. Cereal Chem., 1996, 73: 278-279.
7. M o r r i s  C.F.,  M a s s a  A.N. Puroindoline genotype of the U.S. national institute of standards and technology reference material 8441, wheat hardness. Cereal Chem., 2003, 80(6): 674-678 (http://patapsco.nist.gov/srmcatalogcommon//view_detail.cfm?srm=8441).
8. S y m e s  K.J. The inheritance of grain hardness in wheat as measured by particle-size index. Aust. J. Agric. Res., 1965, 16: 113-123.
9. M a t t e r n  P.J.,  M o r r i s  R.,  S c h m i d t  J.W. e.a. Location of genes for kernel properties in the wheat cultivar «Cheyenne» using chromosome substitution lines. E.R. Sears, L.M.S. Sears (eds.). In: Proc. 4th Intl. Wheat Genet. Symp., University of Missouri, Columbia, MO, 1973: 703-707.
10. L a w  C.N.,  Y o u n g  C.F.,  B r o w n  J.M.S. e.a. The study of grain-protein control in wheat using whole chromosome substitution lines. In: Seed protein improvement by nuclear techniques. International Atomic Energy Agency, Vienna, Austria, 1978: 483-502.
11. G r e e n w e l l  P.,  S c h o f i e l d  J.D. A starch granule protein associated with endosperm softness in wheat. Cereal Chem., 1985, 63: 379-380.
12. J o l l y  C.J.,  R a h m a n  S.,  K o r t t  A.A. e.a. Characterization of the wheat Mr 15000 «grain-softness protein» and analysis of the relationship between its accumulation in the whole seed and grain softness. Theor. Appl. Genet., 1993, 86: 589-597.
13. B e t t g e  A.D.,  M o r r i s  C.F.,  G r e e n b l a t t  G.A. Assessing genotypic softness in single wheat kernels using starch granule-associated friabilin as biochemical marker. Euphytica, 1995, 86: 65-75.
14. G a u t i e r  M.F.,  A l e m a n  M.E.,   G u i r a o  A.M. e.a. Triticum aestivum puroindolines, two basic cysteine-rich seed proteins: cDNA sequence analysis and developmental gene expression. Plant Mol. Biol., 1994, 24: 43-47. 15. M o r r i s  C.F.,  G r e e n b l a t t  G.A.,  B e t t g e  A.D. e.a. Isolation and characterization of multiple forms of friabilin. J. Cereal Sci., 1994, 21: 167-174.
16. R a h m a n  S.,  J o l l y  C.J.,  S k e r r i t t  J.H. e.a. Cloning of a wheat 15-kDa grain softness protein (GSP) in a mixture of puroindoline-like polypeptides. Eur. J. Biochem., 1994, 224: 917-925.
17. B l o c h e t  J.E.,  C h e v a l i e r  E.,  F o r e s t  E. e.a. Complete amino acid sequence of puroindoline, a new basic cystine-rich protein with unique tryptophan-rich domain, isolated from wheat endosperm by Triton X-114 phase partitioning. FEBS Letters, 1993, 329(3): 336-340.
18. D o u l i e z  J.P.,  M i c h o n  T.,  E l m o r j a n i  K. e.a. Mini review: Structure, biological and technological functions of lipid transfer proteins and indolines, the major lipid binding proteins from cereal kernels. J. Cereal Sci., 2000, 32(1): 1-20.
19. T r a n g u i l l i  G.,  H e a t o n  J.,  C h i c a i z a  O. e.a. Substitution and deletions of genes related to grain hardness in wheat and their effect on grain texture. Crop. Sci., 2002, 42: 1812-1817.
20. M c I n t o s h  R.A.,  Y a m a z a k i  Y.,  D e v o s  K.M. e.a. Catalogue of gene symbols for wheat, 2003. http://wheat.pw.usda.gov/ggpages/wgc/2003.
21. D u b r e i l  L.,  G a b o r i t  T.,  B o u c h e t  T. e.a. D. Spatial and temporal distribution of the main isoforms of puroindolines (puroindolin-a and puroindolin-b) and nonspecific lipid transfer protein (ns-LTPs) of Triticum aestivum seed. Relationships with their in vitro antifungal properties. Plant Sci., 1998, 138: 121-135.
22. C a p a r e l l i  R.,  A m o r o s o  M.G.,  P a l u m b o  D. e.a. Two plant puroindolines colocalize in wheat seed and in vitro synergistically fight against pathogens. Plant Mol. Biol., 2005, 58(6): 857-867.
23. W i l l y  P.R.,  T o s i  P.,  E v r a r d  A. E. e.a. Promoter analysis and immunolocalization show that puroindolin genes are exclusively expressed in starchy endosperm cell of wheat grain. Plant Mol. Biol., 2007, 64(1-2): 125-136.
24. G i r o u x  J.,  M o r r i s  C.F. A glycine to serine change in puroindoline b is associated with wheat grain hardness and low levels of starch-surface friabilin. Theor. Appl. Genet., 1997, 95: 857-864.
25. G i r o u x  M.J.,  M o r r i s  C.F. Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b. PNAS USA, 1998, 95: 6262-6266.
26. L i l l e m o  M.,  M o r r i s  C. F. A leucine to prolin mutation in puroindoline b is frequently present in hard wheats from Northern Europe. Theor. Appl. Genet., 2000, 100: 1100-1107.
27. M o r r i s  C.F. Puroindolines: the molecular genetic basis of wheat hardness. Plant Mol. Biol., 2002, 48: 633-647.
28. M c I n t o s h  R.A.,  D e v o s  K.M.,  D u b c o v s k y  J. e.a. Catalog of gene symbols for wheat: Supplement, 2005. (www.grs.nig.ac.jp/.../genes/macgene/supplement2005).
29. M c I n t o s h  R.A.,  D e v o s  K.M.,  D u b c o v s k y  J. e.a. Catalog of gene symbols for wheat: Supplement, 2006. (http://wheat.pw.usda.gov).
30. R a m  S.,  J a i n  N.,  S h o r a n  J. e.a. New frame shift mutation in Indian wheat cultivars Hyb65 and NI5439. J. Plant Biochem. Biotechnol., 2005, 14: 45-48.
31. X i a  L.,  C h e n  F.,  H e  Z. e.a. Occurrence of puroindoline alleles in Chinese winter wheats. Cereal Chem., 2005, 82(1): 38-43.
32. C h e n  F.,  H e  Z.H.,  X i a  X.C. e.a. Molecular and biochemical characterization of puroindoline a and b alleles in Chinese landraces and historical cultivars. Theor. Appl. Genet., 2006, 112: 400-409.
33. M o r r i s  C. F.,  L i l l e m o  M.,  S i m e o n e  M.C. e.a. Prevalence of puroindoline grain hardness genotypes among historically significant North American spring and winter wheats. Crop. Sci., 2001, 41: 218-228.
34. C a n e  K.,  S p a c k m a n  M.,  E a g l e s  H.A. Puroindoline genes and their effects on grains quality traits in Southern Australian wheat cultivars. Aust. J. Agric. Res., 2004, 55: 89-95 35. L i l l e m o  M.,  C h e n  F.,  X i a  X. e.a. Puroindoline grain hardness alleles in CIMMYT bread wheat germplasm. J. Cereal Sci., 2006, 44: 86-92.
36. Puroindoline genotype database, USDA/ARS. (http://www.wsu.edu/~wwql/php/puroindoline.php.).
37. H u a n g  X.Q.,  R o d e r  M.S. Assessment of SNP haplotypes of the puroindoline b gene for grain hardness in Europian wheat varieties by pyrosequencing. (http://pgrc.ink-gatersle-ben.de/puroindoline/index.php).
38. G a u t i e r  M.F.,  C o s s o n  P.,  G u i r a o  A. e.a. Puroindolin genes are highly conserved in diploid ancestor wheats and related species but absent in tetraploid Triticum species. Plant Sci., 2000, 153(1): 81-91.
39. T o s i  P.,  W I l k i n s o n  M.,  H e  G.G. e.a. Novel puroindoline and grain softness protein in Aegilops species with C, D, S, M and U genomes. Theor. Appl. Genet., 2005, 111(5): 1159-1166.
40. T a n c h a k  A.A.,  S c h e m t h a n e r  J.P.,  G i b a n d  A. e.a. Triptophanins: isolation and molecular characterization of oat cDNA clones encoding proteins structurally related to puroindoline and wheat grain softness protein. Plant Sci., 1998, 137: 173-184.
41. B e e c h e r  B.,  S w i d a n s k y  E.D.,  S e e  D. e.a. Mapping and sequence analysis of barley hordoindolines. Theor. Appl. Genet., 2001, 102: 833-840.
42. L a f i a n d r a  D.,  S i m e o n e  M.C. Isolaton and characterization of friabilin genes in rye. J. Cereal Sci., 2005, 41(1): 115-122.
43. M a s s a  A.,  M o r r i s  C. F. Gill Sequence diversity of puroindolin-a, puroindoline-b, and the grain softness protein genes in Aegilops tauschii Coss. Crop. Sci., 2004, 44: 1808-1816.
44. S i m e o n e  M.C.,  G e d y e  K.R.,  G a m e r  R.M. e.a. Conserved regulatory elements identified from a comparative puroindoline gene sequence survey of Triticum and Triticum taxa. J. Cereal Sci., 2006, 44: 21-33.
45. S e e  D.A.,  G i r o u x  M.,  G i l l  B.S. Effect of multiple copies of puroindoline genes on grain softness. Crop Sci., 2004, 44:1248-1253. 46. G a z z a  L.,  C o n t i  S.,  T a d d e i  F. e.a. Molecular characterization of puroindolines and their encoding genes in Aegilops ventricosa. Mol. Breed., 2006, 17(3): 185-297.
47. T r a n g u i l l i  G.,  L i j a v e t z k y  D.,  M u z z i  Q. e.a. Genetic and physical characterization of grain texture-related loci in diploid wheat. Mol. Gen. Genet., 1999, 262: 846-850.
48. T u r u n b u l l  K.M.,  T u r n e r  M.,  Y a m o m o t o  M. e.a. The organization of genes tightly linked to the Ha locus in Aegilops tauschii, the D-genome donor to wheat. Genome, 2003, 46(2): 330-338.
49. C h a r n e t t  N.,  S e i s e  J.,  S a b o t  F. e. a. Molecular basis of evolutionary events that shaped the hardness locus in diploid wheat species (Triticum and Aegilops). The Plant Cell, 2005, 17: 1033-1045.
50. M a s s a  A.,  M o r r i s  C.F. Molecular evolution of the puroindoline-a, puroindoline-b, and grain softness protein-1 genes in the tribe Triticeae. J. Mol. Evol., 2006, 63(4): 526-536.
51. С a m p b e l l  K.G.,  F i n n e y  P.L.,  B e r g m a n  M.E. e.a. Quantitative trait loci associated with milling and baking quality in soft ´ hard wheat cross. Crop. Sci., 2001, 41: 1275-1281.
52. M a r t i n  J.M.,  F r o h b e r g  R.C.,   M o r r i s  C.F. e.a. Milling and Bread making traits associated with puroindoline sequence type in hard red spring wheat. Crop Sci., 2001, 41: 228-234.
53. L i l l e m o  M.,  R i n g l u n d  K. Impact of puroindoline b alleles on the genetic variation for hardness in soft ´ hard wheat crosses. Plant Breed., 2002, 121: 210-217.
54. I g e r i a s  G.,  G a b o r i t  T.,  O u r y  F.X. e.a. Genetic and environmental effects on puroindoline-a and puroindoline-b content and their relationship to technological properties in French bread wheats. J. Cerial Sci., 2001, 11: 37-41.
55. M a r t i n  J.M.,  M e y e r  F.D.,  S m i d a n s k y  E.D. e.a. Complementation of pin a (null) allele with the wild type pin a sequence restores a soft phenotype in transgenic wheat. Theor. Appl. Genet., 2006, 113(8): 1563-1570.
56. M a r t i n  J.M.,  M e y e r  F.D.,  M o r r i s  S.F. e.a. Pilot scale milling characteristics of transgenic isolines of a hard wheat over-expressing puroindolines. Crop Sci., 2007, 47: 497-504.
57. S w a n  C.G.,  M e y e r  F.D.,  H o g g  A.C. e.a. Puroindoline b limits binding of puroindoline a to starch and grain protein softness. Crop Sci., 2006, 46: 1656-1665.
58. W a n j u g u  H.W.,  H o g g  A.C.,  M a r t i n  J.M. e.a. The role of puroindoline A and B individually and in combination on grain hardness and starch association. Crop Sci., 2007, 47: 67-76.
59. B o n f e  M.,  K o n g  L.,  T r a n g u i l l i  G. e.a. Reduction of T. monococcum chromosome segment carrying the softness genes pina and pinb translocated to bread wheat. Crop. Sci., 2007, 47: 821-826.
60. G e d y e  K.R.,  M o r r i s  C.F.,  B e t t g e  A.D. Determinatrion and evaluation of the sequence and textural effects of the puroindoline a and puroindoline b genes in population of synthetic hexaploid wheat. Theor. Appl. Genet., 2004, 109(8): 1597-1603.
61. O w e n s  F.N.,  Z i n n  R.R., K i m  Y.K. Limits to starch digestion in the ruminant small intestine. J. Anim. Sci., 1986, 63: 1634-1648.
62. P h i l i p p e a u  C.F.,  L e d e M o n r e d o n  F.,  M i c h a s l  et-D o r e a u  B. Relationship between ruminal starch degradation and the physical characteristics of corn grain. J. Anim. Sci., 1999, 77: 238-243.
63. S w a n  C.G.,  B o w m a n  J.S.P.,  M a r t i n  J.M. e.a. Increased puroindoline levels slow ruminal digestion of wheat (Triticum aestivum L.) starch by cattles. Anim. Sci., 2006, 84: 641-650.
64. B r o e k a e r t  W.F.,  C a m m u e  B.P.A.,  D e B o l l e  M.F.C. e.a. Antimicrobial peptides from plants. Plant Sci., 1997, 16: 297-323.
65. K r i s h n a m u r t h y  K.,  B a l c o n i  J.E.,  S h e r w o o d  J.E. e.a. Increased tolerance to fungal diseases of rice plant transformed with puroindoline genes. Mol. Plant-Microbe Interact., 2001, 13: 1255-1260.
66. K r i s h n a m u r t h y  K.,  G i r o u x  M.J. Expression of wheat puroindolines genes in transgenic rice enhances grain softness. Nat. Biotechnol., 2001, 19: 162-166.
67. G i r o u x  M.J.,  S h e r w o o d  J.E.,  K r i s h n a m u r t h y  K. e.a. Transgenic plants expressing puroindolines and methods for producing such plants. USA patent 6600090, 2003. (http://www./freepatentsonline.com/6600090.html).
68. J i n g  W.,  D e m c o e  A.R.,  V o g e l  H.J. Conformation of a bactericidal domain of puroindoline a; structure and mechanism of action of a 13-residue antimicrobial peptide. J. Bacteriol., 2003, 185(16): 4938-4947.
69. E p a n d  E.M.,  V e g e l  H.J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochem. Biophys. Acta, 1999, 1462: 11-28.
70. C h a n e t t  P. Puroindolines form ion channels in biological membranes. Biophysical J., 2003, 84: 2416-2426.

PUROINDOLINES AND PROSPECTS OF SELECTION OF SOFT WHEAT ON QUALITY AND RESISTANCE (review)

A.G. Khakimova, O.P. Mitrofanova

The results of molecular-genetic investigation of seed endosperm texture in soft wheat are discussed. The authors consider the biochemical characteristics of puroindolines — one of main lipoproteid family, determining the differences in endosperm texture, the genetic control of these proteins and geographic expansion of genes alleles. The prospects are discussed the usage of genetic variability of puroindolines in selection for improvement of flour-grinding, bread-making and confectionary properties of corn, the improvement of quality of the fodder and the increase of plant resistance to pathogens.

Key words: common wheat, puroindolines, hardness/softness, grain quality.

Оформление электронного оттиска